徐 巍 郭 健 徐國興

骨髓間充質干細胞在視網膜疾病研究中的應用

徐 巍 郭 健 徐國興

福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，福建省眼科研究所

視網膜疾病是眼科疾病研究中的難點，也是致盲的重要原因。多種原因引起的視網膜疾病的共同結果是光感受器細胞或神經節(jié)細胞的變性壞死。當前對壞死的視神經細胞缺乏有效治療措施。因此，利用干細胞，尤其是具有多向分化潛能的骨髓間充質干細胞（Marrow Mesenchymal Stem Cells, MSCs），誘導分化成為視網膜細胞；恢復和重建視網膜的結構和功能有望成為視網膜疾病治療的新途徑。

骨髓間充質干細胞 可塑性 視網膜

視網膜是由視網膜色素上皮層和神經感覺層組成的對光敏感且精細的膜樣結構，是視覺形成的基礎。任何原因引起的視網膜血管，神經感覺組織和色素上皮的病變均可導致視力損傷，甚至致盲。各種原因引起的視網膜疾病的最終結果都是視網膜神經細胞的壞死或凋亡，造成不可逆的損傷，如：視網膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)、年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration, AMD）等。雖然目前有多種治療方法，但療效均欠佳。隨著干細胞研究的深入，利用干細胞，尤其是MSCs，誘導分化為視網膜各種細胞，恢復視網膜的結構和功能可能有望成為新的治療途徑。

干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有分化的全能性，可分化成為各種類型的細胞[1]。利用胚胎干細胞移植入受損部位可使組織再生恢復功能。已有報道指出胚胎干細胞可以向視網膜前體細胞誘導分化[2]。胚胎干細胞對于視網膜變性疾病的治療有很大潛力，但是由于胚胎干細胞的研究在倫理方面存在很大爭議。此外，胚胎干細胞的MHC-Ⅰ類分子隨細胞分化而不斷增加，使其排斥反應成為限制其應用的一個重要問題。成體干細胞是存在于個體組織中的具有多向或單向分化的潛能，廣泛存在于骨髓、肝臟、心肌、腦、及視網膜等組織中。在特定情況下，如組織損傷等，可增殖分化修復受損的組織。各種成體干細胞中，以MSCs具有多向分化潛能，可分化成為包括骨、軟骨、脂肪細胞、筋膜、肌肉及骨髓基質等[3]，而成為當前研究的熱點。此外，MSCs克服了胚胎干細胞的缺點，來源豐富，取材方便，易于分離純化，可塑性強且不存在倫理學問題。

1 MSCs概述

1867年Cohnheim在研究損傷修復時，利用可溶性苯胺染料經靜脈注射后發(fā)現染料出現在遠端受損修復部位的細胞中。并由此推測損傷部位的細胞是來自血液的，而且很可能來自骨髓。雖然這一推斷至今尚未得到證實，但是最近的研究證實骨髓中確實存在一種不同于造血干細胞且具有多向分化潛能的干細胞，即MSCs。

1.1 MSCs的細胞學特點

MSCs除具有細胞核漿比值大，細胞器少等干細胞的一般形態(tài)學特點外，還有細胞呈梭形，粘附能力強，每2~4個細胞可形成一個集落單元[4]。MSCs分裂周期在33h左右，具有較強的分裂能力。體外培養(yǎng)的MSCs經過20~30次的細胞倍增后，應用帶微孔的膠囊將其包繞并植入鼠的腹膜，可發(fā)現MSCs仍可分化成為纖維、骨、軟骨等組織[5]。

1.2 MSCs的免疫標志物

利用流式細胞儀分析顯示，MSCs大多數可表達SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等。MSCs不表達造血干細胞的標志物，包括脂多糖受體CD14、CD34以及白細胞的一般標志物CD45[3]。所以目前認為可以把CD44、CD105、CD106等骨髓細胞標志物陽性等作為MSCs免疫學鑒定方法。

1.3 MSCs誘導分化的分子因素

作為間質來源的干細胞，MSCs具有多向分化潛能且分化的方向視誘導因素的不同而各異。MSCs分化過程中涉及多種細胞因子。各種細胞因子的作用方式和信號傳導過程也不同。其中，受體酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）可從細胞的增殖、生長、分化等方面調控細胞。過程包括配體—受體的結合，受體磷酸化并活化下游分子，通過級聯反應對細胞生長分化等發(fā)揮重要作用[6]。影響MSCs生長分化的蛋白質分子包括多種生長因子分子，如BMP,activin等，和多種類型的白介素。這些分子通過不同時相和濃度作用于MSCs，使其生長并向多種細胞類型分化。Irina Kratchmarova等[6]，在研究多種細胞因子對MSCs對分化的作用機制時，發(fā)現hMSCs分化成為骨樣細胞是表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）刺激產生的，而不是血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）。多數細胞內信號傳導蛋白可同時傳導兩種配體的刺激信號，但是磷酯酰肌醇激酶３（PI3K）途徑卻是單獨由PDGF激活的。利用PI3K的抑制劑可以使PDGF誘導分化的效應回退。這表明該途徑可能是一個細胞分化的控制點。此外，Runx2與PPARγ是調節(jié)MSCs分化的的兩個關鍵轉錄因子，通過以上兩個轉錄因子的活化分別驅動MSCs分化成為骨母細胞或脂肪細胞。同時，14-3-3結合蛋白TAZ對Rux2與PPARγ依賴性基因有分別共同激活和抑制的作用。MSCs的分化分子機制復雜，對其進行全面的研究有助于成功誘導MSCs分化成為目的細胞。

2 MSCs在視網膜疾病研究中的應用

多種試驗已證實MSCs可以分化成為包括視網膜的各種細胞在內的多種類型組織細胞或前體細胞。由于視網膜是由RPE、光感受器細胞和神經節(jié)細胞等組成。RPE和神經感覺層的細胞分別由胚胎發(fā)育時的神經外胚葉的外層和內層發(fā)育而來，各種細胞高度分化。因此，要實現將MSCs成功誘導分化成為視網膜細胞就需要不同的誘導條件。當前對于MSCs在視網膜疾病研究中的應用，大體是通過兩條途徑來實現的，即體外培養(yǎng)誘導和眼內移植。兩條途徑各有優(yōu)缺點。利用體外誘導可以通過人工添加各種生長因子等，明確各種蛋白質分子對MSCs誘導的作用。培養(yǎng)液中成分明確便于分析，但是在尚未明確MSCs分化成為視網膜細胞的機制之前，體外培養(yǎng)無法準確誘導MSCs分成特定類型的細胞或前體細胞；成功誘導較為困難。與體外培養(yǎng)相反MSCs移植則可以應用體內適于MSCs分化的微環(huán)境誘導其分化成為特定類型的細胞或前體細胞。甚至某些分化的細胞可具有部分功能。但是眼內移植同樣存在缺點。如體內微環(huán)境復雜，存在多種促進或抑制分化的因素。此外，復雜的體內環(huán)境對于MSCs誘導因素的分析同樣是存在困難的。

2.1 細胞標志物的檢測

檢測MSCs是否被誘導成為目的細胞需要一定的檢測指標。而在細胞類型的檢測中，免疫標志物是較為可靠的指標，且在成為功能細胞前即可出現。幾種視網膜細胞具有各自的標志物，RPE，可表達角蛋白、RPE65等，光感受器細胞表達視紫紅質、視蛋白等。神經節(jié)前體細胞則可表達巢蛋白。神經膠質細胞可表達膠質酸性纖維蛋白等。所以當前對于MSCs誘導分化成為視網膜各細胞的研究也多采用這些標志物作為初步檢測指標。而在功能檢測方面，RPE常檢測其是否形成色素或類似色素的顆粒。神經細胞則應用到電生理，如膜片鉗等技術等；或是檢測是否存在突觸囊泡等。

2.2 MSCs誘導成為視網膜各細胞的關鍵

由于視網膜各種細胞高度分化，故利用MSCs誘導分化成為視網膜細胞需詳盡了解誘導過程的關鍵因素。當前多數研究是將MSCs與特定細胞共培養(yǎng)并適當添加生長因子或利用體內微環(huán)境誘導。這些方法尚不能把誘導過程的關鍵因子一一闡明，但眼的發(fā)育過程為我們提供了可能與誘導過程存在密切關系的某些因子。

RPE的形成與TGFβ的超家族成員BMP和activin存在密切關系[7]，其中BMP對RPE的正確發(fā)育有重要作用。因為Noggin的過渡表達可導致區(qū)域特異性的RPE完整性缺損[8]。神經視網膜可由視杯的神經上皮發(fā)育而來或由RPE轉分化形成，FGF家族成員的分子對分化的兩條途徑均有重要作用[9]。bFGF可使神經上皮向神經視網膜轉換[10]，而胚鼠RPE中FGF9的表達則可使RPE向神經視網膜轉變[11]。而在光感受器發(fā)育時兩個重要的轉錄因子，視網膜鏈氨基酸拉鏈（Nlz）和核受體（Nrze3）可以調節(jié)視桿細胞特異性的轉錄，同時抑制視錐細胞相關的基因轉錄表達[12]。二者的同時缺失則可使視網膜前體細胞向視錐細胞分化[13]。

2.3 體外培養(yǎng)誘導MSCs向視網膜細胞分化

Urs Vossmerbaeumer等[14]利用RPE條件培養(yǎng)液培養(yǎng)MSCs，通過研究添加血管活性腸肽（VIP）是否可以調節(jié)MSCs的分化進程時發(fā)現MSCs可以表達RPE的某些特異性標志物，如：bestrophin,角蛋白8,18以及RPE65等；而且在進一步檢測細胞功能時發(fā)現，利用促黑素（MSH）可以刺激已分化的MSCs表達色素顆粒，這些結果表明MSCs具有向神經外胚層分化的潛能，可以產生具有RPE特性的細胞表型且具有一定得功能。有學者利用鼠MSCs與不同發(fā)育時相的神經視網膜前體細胞（RPC）共培養(yǎng)時發(fā)現，與EB.5RPC共培養(yǎng)3d后的MSCs表現出神經元樣外觀，膜出現突起的結構。利用RT-PCR 和免疫熒光可檢測到Pax6,Brn36和巢蛋白表達，如果將培養(yǎng)時間延長到7d或14d則無法檢測到Pax6,Brn36的表達，而且在14d的培養(yǎng)后MSCs恢復原來的梭形外觀，由此認為MSCs自身可能存在著反饋調節(jié)，可以再一定程度抑制其分化，以維持干細胞的特性。

CD90----+的MSCs的可塑性已被多種實驗證實,CD90+的MSCs可被包括牛磺酸、actinvin A、和EGF在內的多種介質誘導分化成為視網膜神經細胞樣的細胞。被誘導的MSCs中30%可表達光感受器細胞的特異性標志物RHOS；同樣也有30%的細胞可表達無長突細胞的標志物CRABP1。另外尚有少數細胞可被這三種介質誘導表達巢蛋白。

2.4 MSCs移植誘導分化成為視網細胞

多數MSCs體外移植治療視網膜疾病研究的途徑是利用分離培養(yǎng)的MSCs經視網膜下腔注射。有學者用GFP或BrdU標記CD90+的MSCs后注射入成年RCS鼠視網膜下腔。2W后發(fā)現CD90+的MSCs與宿主視網膜整合形成類似光感細胞層的結構，并且細胞可出現Opsin、RHOS、突觸囊泡等，而分裂期細胞標志物PCNA并未測得。這表明細胞是進行了分化而不是分裂，這一結果證實MSCs可以分化成為視網膜細胞.該研究為視網膜變性病變的細胞療法的研究提供了良好的前景和研究途徑。

Wang.S等[15]利用RCS鼠的MSCs分別通過尾靜脈和視網膜下腔途徑對同基因鼠進行注射后，在不同時相進行光感細胞血管功能形態(tài)學方面的檢查，發(fā)現視網膜下腔注射后可以很大程度上挽救視網膜的形態(tài)和功能，而經尾靜脈注射則可對整個視網膜的光感細胞有挽救作用，兩條途徑結合則可以同時挽救光感細胞和視覺功能。

3 問題與展望

干細胞研究是當前的一個熱點和難點。利用MSCs誘導分化成為視網膜細胞，可以為多種視網膜變性疾病帶來希望，但是MSCs很難按預定方向分化，為此,需要從分子水平闡明MSCs分化過程的關鍵因子，并結合最新的組織工程技術從多方面研究MSCs的分化過程，實現其定向誘導分化成為視網膜各種細胞。在此過程中需要研究人員的不斷探索。

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1.福建省重點科研課題(基金編號：2008Y0040)；2.國家衛(wèi)生部科研基金課題(基金編號:WKJ2008-2-617)。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。