李金茹 牛文彥 初桂蘭

餐后升高的血糖80%由胰島素刺激骨骼肌攝取，葡萄糖轉運入細胞是骨骼肌葡萄糖代謝的限速步驟，由胰島素敏感的葡萄糖轉運體4型（glucose transporter 4,GLUT4）完成?；A狀態(tài)下，GLUT4主要位于細胞內(nèi)囊泡上，少量位于細胞膜上。胰島素作用下，GLUT4從細胞內(nèi)囊泡轉位到細胞膜上，從而轉運更多的葡萄糖進入細胞[1]。另一個生理性刺激GLUT4轉位的因素是運動/肌肉收縮。相對于胰島素作用機制而言，運動/肌肉收縮促進葡萄糖攝取的機制尚不明確。目前研究認為，收縮刺激骨骼肌葡萄糖攝取主要通過2個通路，一是腺苷酸激酶（AMPK）途徑[2]，運動收縮消耗能量，AMP/ATP 升高，激活AMPK，促進骨骼肌葡萄糖轉運；另一是Ca2+介導的信號，胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高觸發(fā)肌肉收縮，激活下游信號分子。蛋白激酶C（PKC）為Ca2+的下游信號分子之一[3]。PKC可由二酰甘油（DAG）激活，肌肉收縮可增加細胞內(nèi)DAG含量，激活PKC[4]。PKC在收縮刺激骨骼肌攝取葡萄糖的機制中的作用目前說法不一。本研究應用PKC激活劑佛波酯（PMA），觀察激活PKC對GLUT4轉位的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 PMA、PKC抑制劑Go6976、Go6983、鄰苯二胺、抗myc多克隆抗體購自Sigma。DMEM高糖和低糖培養(yǎng)基購自天潤善達（GIBCO分裝）。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為以色列優(yōu)級血清。馬血清（horse serum，HS）購自美國GIBCO。細胞培養(yǎng)耗材購自Corning。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 穩(wěn)定過表達GLUT4myc的C2C12小鼠骨骼肌細胞株由本課題組確立。C2C12GLUT4myc細胞用含 10%FBS (體積分數(shù)，V/V)和 5 mg/L殺稻瘟菌素（blasticidin）的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，按4×104/mL接種于培養(yǎng)板中，待細胞匯合度達100%時，用含5%HS(V/V)DMEM高糖培養(yǎng)基分化細胞為肌管。C2C12GLUT4myc肌管用無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)3 h后進行實驗處理。根據(jù)不同孵育細胞和條件分為PMA組（0.1 μmol/L PMA孵育20 min），Go6983+PMA 組（10 μmol/L Go6983 預孵育 30 min，10 μmol/L Go6983與0.1 μmol/L PMA 共孵育 20 min）、Go6976+PMA組（10 μmol/L Go6976 預孵育 30 min，10 μmol/L Go6976 與 0.1 μmol/L PMA 共 孵 育 20 min）、PMA24 h+PMA 組（1 μmol/L PMA預孵育24 h后，0.1 μmol/L PMA孵育 20 min）和PMA24 h+Go6976+PMA組（1 μmol/L PMA預孵育24 h后，10 μmol/L Go6976 預 孵 育 30 min，10 μmol/L Go6976 與 0.1 μmol/L PMA共孵育20 min），每組細胞均以Basal組（未處理）作為對照。

1.3 偶聯(lián)抗體的吸光度分析法 處理后的C2C12GLUT4myc肌管經(jīng)多聚甲醛固定，脫脂牛奶封閉后，用多克隆抗myc抗體室溫孵育1 h；用偶聯(lián)過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG室溫孵育肌管1 h；加入底物鄰苯二胺溶液，反應15~30 min后終止，用酶標儀測定上清液492 nm的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PMA組、Go6983+PMA組及Go6976+PMA組C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc轉位比較 PMA組與Basal組相比，GLUT4myc轉位增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。Go6983+PMA組GLUT4myc轉位比PMA組降低92%（P<0.01），與Basal組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。Go6976+PMA組GLUT4myc轉位與PMA組相比降低，與Basal組和Go6983+PMA組相比增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表 1。

表1 PMA組、Go6983+PMA組、Go6976+PMA組GLUT4myc 轉位 （n=4s）

表1 PMA組、Go6983+PMA組、Go6976+PMA組GLUT4myc 轉位 （n=4s）

觹觹P ＜ 0．01

組別統(tǒng)計學處理P Basal組（1）PMA 組（2）Go6983＋PMA 組（3）Go6976＋PMA 組（4）F與Basal組吸光度值比值1.000±0.000 2.770±0.127 1.135±0.246 2.005±0.305 64.331**組比1∶2 1∶3 1∶4 2∶3 2∶4 3∶4<0.001 0.825 0.027 0.001 0.041 0.023

2.2 PMA組、PMA24 h+PMA組、PMA24 h+Go6976+PMA組C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc轉位比較 PMA24 h+PMA組GLUT4myc轉位比PMA組減少了74%（P<0.001）。PMA24 h+Go6976+PMA 組GLUT4myc轉位與PMA組相比降低了89%（P<0.001），與Basal組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表 2。

表2 PMA組、PMA 24 h+PMA組、PMA 24 h+Go6976+PMA 組 GLUT4myc轉位 （n=4±s）

表2 PMA組、PMA 24 h+PMA組、PMA 24 h+Go6976+PMA 組 GLUT4myc轉位 （n=4±s）

觹觹P ＜ 0．01

組別統(tǒng)計學處理P Basal組（1）PMA 組（2）PMA 24 h＋PMA（3）PMA 24 h＋Go6976＋PMA（4）F與Basal組吸光度值比值1.000±0.000 2.745±0.169 1.460±0.155 1.190±0.163 128.243**組比1∶2 1∶3 1∶4 2∶3 2∶4 3∶4 0.001 0.036 0.333<0.001<0.001 0.227

3 討論

PKC是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[5]。PKC家族有3種同工酶，cPKC、nPKC和非典型PKC。nPKC和cPKC可被DAG激活，cPKC還可被升高的Ca2+激活，而aPKC不受DAG和Ca2+的調(diào)節(jié)[6]。PKC抑制劑鈣感光蛋白（Calphostin C）可以作用于nPKC和cPKC的DAG結合位點，抑制骨骼肌收縮刺激的葡萄糖轉運[7]，推測nPKC或cPKC參與骨骼肌葡萄糖轉運。

PMA作為DAG的類似物，是cPKC和nPKC的激活劑。PMA可以與nPKC和cPKC的DAG結合位點結合，從而激活PKC。PMA急性刺激可以增加骨骼肌葡萄糖轉運[8]。本實驗中，PMA急性刺激C2C12 GLUT4myc肌管（PMA組）的GLUT4myc轉位，表明PMA激活nPKC和cPKC后，活化的PKC可以使GLUT4myc從肌漿轉位到細胞膜，提示激活PKC（nPKC和cPKC）可調(diào)節(jié)骨骼肌GLUT4轉位。

為了進一步確定nPKC和cPKC在骨骼肌GLUT4轉位的信號轉導中的作用，本實驗應用了PKC抑制劑Go6983和Go6976。Go6983為nPKC和cPKC的抑制劑。Go6983+PMA組C2C12GLUT4myc肌管經(jīng)Go6983預孵育后，可以完全抑制PMA急性刺激的GLUT4myc的轉位，即Go6983抑制了nPKC和cPKC的激活，從而完全抑制了GLUT4myc的轉位，說明cPKC和nPKC介導PMA急性刺激的GLUT4myc轉位。Go6976為cPKC特異性抑制劑，Go6976+PMA組C2C12GLUT4myc肌管經(jīng)Go6976預孵育可以部分抑制PMA急性刺激的GLUT4myc轉位，即Go6976抑制了cPKC的激活，從而抑制了部分GLUT4myc轉位，說明cPKC參與了C2C12 GLUT4myc肌管的 GLUT4轉位的信號轉導，與Go6983對GLUT4 myc轉位的完全抑制相比，其未被Go6976抑制的GLUT4轉位部分應為nPKC介導，表明nPKC同樣參與了骨骼肌GLUT4轉位的信號轉導。

高濃度PMA慢性孵育可以下調(diào)PKC的表達，特別是在C2C12細胞中，主要下調(diào)nPKC（PKCε）的表達[9]。本實驗中，PMA 24 h+PMA組C2C12GLUT 4myc肌管經(jīng)高濃度PMA慢性預孵育后，再應用PMA急性刺激，GLUT4myc轉位雖然較Basal組增加，但是幅度比PMA急性刺激的GLUT4myc的轉位明顯降低，推測是由于慢性孵育下調(diào)nPKC的表達，從而部分抑制PMA急性刺激的GLUT4myc轉位，說明nPKC參與C2C12GLUT4myc肌管的GLUT 4myc的轉位。而另一部分未受抑制的GLUT4myc轉位可被cPKC抑制劑Go6976抑制，說明cPKC也參與了C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc的轉位。

綜上所述，PMA可以與nPKC和cPKC的DAG結合位點結合，激活PKC，增強骨骼肌GLUT4轉位。抑制nPKC或cPKC的活性，降低PMA刺激的骨骼肌GLUT4轉位。因此，激活nPKC或cPKC可調(diào)節(jié)骨骼肌GLUT4轉位。本課題組經(jīng)初步實驗發(fā)現(xiàn)，收縮刺激C2C12GLUT4myc肌管，可激活PKC,其是否介導收縮調(diào)節(jié)GLUT4轉位的機制有待進一步研究。

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