蔣文 邊莉 李瑰琦 馬麗菊 唐睿珠 何永文

（1.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔研究所，云南 昆明 650031；2.荊州市第一人民醫(yī)院 口腔科，湖北 荊州 434000；3.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 病理科，云南 昆明 650032）

高溫治療癌癥已在臨床上得到較廣泛應(yīng)用，并取得較滿意效果。近年研究發(fā)現(xiàn)，臨床常規(guī)熱療（41～45℃）主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡治療腫瘤，但分子學(xué)機(jī)制尚未完全清楚。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞漿內(nèi)的脂質(zhì)依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和死亡，可作為腫瘤治療靶點(diǎn)[1-2]。其家族成員PKC-δ在不同類型的細(xì)胞中、不同刺激作用下可發(fā)揮促凋亡或抗凋亡的功能[3-4]。但其在熱療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的作用尚待探索。因此，本研究以人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用PKC-δ的活化抑制劑Rottlerin研究熱誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡時(shí)PKC-δ的作用，以期為臨床腫瘤熱療提供新的治療思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器

人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基（Thermo公司，美國），PKC-δ抑制劑Rottlerin（Alexis公司，瑞士），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Amresco公司，美國），PKC-δ抗體（BD公司，美國），羊抗鼠（Ⅱ抗）（KPL公司，美國），碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Rhodamine 123及Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物研究所。電熱恒溫水浴箱（江蘇環(huán)保儀器廠），Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀（Beckman公司，美國）。DM LS2顯微鏡（Leica公司，德國），DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠），酶標(biāo)儀（One Lambda公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中（加青霉素1×105U·L-1、鏈霉素1×102mg·L-1）37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞熱處理 取對(duì)數(shù)生長期且密度為培養(yǎng)瓶面積的80%～90%細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，分成2組，分別加入Rottlerin（DMSO配制，終濃度10 μmol·L-1）和等體積的DMSO預(yù)處理細(xì)胞30min。43℃水浴槽中加熱細(xì)胞0、40、80、120min。

1.2.3 凋亡率分析 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)24 h，收獲細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5min，4℃冷PBS洗滌2次，70%預(yù)冷乙醇重懸細(xì)胞4℃固定過夜，PBS洗滌后100μg·mL-1PI 4℃避光染色30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，以G0/G1前期亞二倍體峰為凋亡峰，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western雜交分析 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)4 h，收獲細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞15min，4℃ 12 000 r·min-1離心15min，提取全細(xì)胞溶解液，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，加一抗PKC-δ，4℃孵育過夜，TBST洗滌，5 min×3次，加二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌，5min×3次，化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.5 線粒體膜電位分析 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)24 h，參考文獻(xiàn)[5]的方法，終質(zhì)量濃度為10μg·mL-1Rhodamine 123與細(xì)胞共培養(yǎng)30 min，收獲細(xì)胞，PBS洗滌，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Caspase-3活性的檢測(cè) 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)16 h，收獲細(xì)胞，冰上裂解15min，提取全細(xì)胞溶解液，調(diào)整為相同蛋白濃度。取蛋白樣品40μL加入50μL檢測(cè)緩沖液中，再加入10μL無色的反應(yīng)底物Ac-DEVD-pNA，37℃孵育過夜。待測(cè)樣品液各100μL轉(zhuǎn)移至96孔板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)空白對(duì)照液和8個(gè)待測(cè)樣品在波長為405 nm處的吸光度A值，以A405nm表示Caspase-3的相對(duì)活性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用方差分析，兩組間差異比較采用LSD分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的凋亡率

熱處理后24 h，隨加熱時(shí)間延長，經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞凋亡率都逐漸增加（圖1）。

各加熱時(shí)間點(diǎn)2種方法預(yù)處理的細(xì)胞凋亡率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，未加熱時(shí)經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞凋亡率無差異（P＞0.05）；加熱40、80、120min，2種方法預(yù)處理的細(xì)胞凋亡率有顯著性差異（P＜0.01，表1）。

表1 各組Tca8113細(xì)胞的凋亡率（n=3，%，±s）Tab 1 Apoptosis rate of Tca8113 cells induced by heating（n=3，%，±s）

表1 各組Tca8113細(xì)胞的凋亡率（n=3，%，±s）Tab 1 Apoptosis rate of Tca8113 cells induced by heating（n=3，%，±s）

細(xì)胞凋亡率0min 40min 80min 120min Tca8113-Rottlerin組 4.76±0.88 12.3±1.91 31.5±2.61 36.53±0.65 Tca8113-DMSO組 4.90±0.72 22.1±1.35 43.2±1.57 49.90±1.25 P值 P＞0.05 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01項(xiàng)目

2.2 Western雜交分析結(jié)果

未加熱時(shí)經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞，全長PKC-δ（7.8×104）表達(dá)明顯，4×104的催化片段（protein kinase C-δ catalytic fragment，PKC-δCF）無明顯表達(dá)；加熱40min后，經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理Tca8113細(xì)胞全長PKC-δ和PKC-δCF都表達(dá)，但未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞中PKC-δCF表達(dá)水平高于Rottlerin預(yù)處理的細(xì)胞（圖2）。以上結(jié)果說明加熱可裂解活化PKC-δ，Rottlerin能抑制熱誘導(dǎo)PKC-δ裂解活化。

2.3 細(xì)胞線粒體膜電位強(qiáng)度變化結(jié)果

隨熱處理時(shí)間延長，經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞弱熒光部分細(xì)胞含量都逐漸增高，但未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞較Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞更明顯。加熱40、80、120min，經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞的弱熒光細(xì)胞百分比經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異（P＜0.01，圖3，表2）。

表2 各組Tca8113細(xì)胞弱熒光細(xì)胞百分比（n=3，%，±s）Tab 2 Percentage of hypofluorescence of Tca8113 cells induced by heat（n=3，%，±s）

表2 各組Tca8113細(xì)胞弱熒光細(xì)胞百分比（n=3，%，±s）Tab 2 Percentage of hypofluorescence of Tca8113 cells induced by heat（n=3，%，±s）

2.4 Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞A405nm值隨加熱時(shí)間的延長而逐漸增加，表明Caspase-3的活性隨加熱時(shí)間的延長而逐漸增加。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，未經(jīng)加熱處理，經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞A405nm值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），40、80、120min相同加熱時(shí)間，Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞的A405nm值低于未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞的A值（P＜0.01，表3）。

表3 各組Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性（n=3，±s）Tab 3 Relative activity of Caspaes-3 in Tca8113 cells（n=3，±s）

表3 各組Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性（n=3，±s）Tab 3 Relative activity of Caspaes-3 in Tca8113 cells（n=3，±s）

3 討論

PKC-δ是新型PKC亞型的成員，廣泛存在于各種組織如腦組織和上皮組織細(xì)胞中，具有促凋亡作用。凋亡刺激激活的PKC-δ從胞漿轉(zhuǎn)移至亞細(xì)胞器，磷酸化相應(yīng)的底物，激活Caspase級(jí)聯(lián)，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而Rottlerin可抑制這一過程[4]。PKC-δ對(duì)細(xì)胞的生存有負(fù)面作用，PKC-δ可增強(qiáng)放療的凋亡誘導(dǎo)作用，提高放療的敏感性[6-7]；阻斷PKC-δ的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增加對(duì)抗腫瘤藥物的抗拒性[8]。PKC-δ是凋亡因子誘導(dǎo)多種類型腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要激酶。喜樹堿類似物NSC606985處理U937、NB4細(xì)胞，硼替佐米和三氧化二砷處理K562，都出現(xiàn)PKC-δ活化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]；FTY720可激活PKC-δ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制PKC-δ活化導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對(duì)FTY720的抗拒性增加[11]；P53、P73和Fas受體缺乏的Hep3B細(xì)胞中，PKC-δ和c-Abl是阿霉素、順鉑、5-氟尿密啶誘導(dǎo)凋亡所需要的蛋白激酶[12]；而Rottlerin或負(fù)顯性突變的PKC-δ可抑制這些凋亡因子誘導(dǎo)的PKC-δ活化及其誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生。

PKC-δ全酶長7.8×104，裂解活化后主要形成PKC-δ CF（4.0×104）和PKC-δ RF。PKC-δCF是結(jié)構(gòu)性的活化酶，對(duì)許多細(xì)胞類型有毒性作用；是強(qiáng)效力的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子，能觸發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase，誘導(dǎo)核內(nèi)DNA片段化和細(xì)胞凋亡。研究[13]證實(shí)，熱誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡中，PKC-δ裂解活化，PKC-δCF的表達(dá)水平提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加熱后PKC-δCF在Tca8113細(xì)胞中表達(dá)水平提高。但相同熱處理?xiàng)l件下，Rottlerin可抑制熱誘導(dǎo)的PKC-δ的裂解活化和降低細(xì)胞凋亡率。表明熱活化的PKC-δ可促進(jìn)熱誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡。

線粒體是PKC-δ的作用靶位，激活的PKC-δ轉(zhuǎn)位線粒體，導(dǎo)致跨膜電位崩解和細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞凋亡發(fā)生，而Rottlerin可抑制PKC-δ活化，抑制PKC-δ誘發(fā)的跨膜電位崩解和細(xì)胞凋亡[7]。Rhodamine 123是一種活細(xì)胞線粒體的陽離子熒光染料，正常細(xì)胞Rhodamine123熒光強(qiáng)度高，凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度減低，壞死細(xì)胞不能吸收Rhodamine 123，不發(fā)熒光。本實(shí)驗(yàn)觀察到，Rottlerin預(yù)處理Tca8113細(xì)胞，43℃熱處理40、80、120min后24 h，其弱熒光細(xì)胞百分含量低于未經(jīng)Rottlerin處理的Tca8113細(xì)胞；而未加熱時(shí)兩者弱熒光細(xì)胞百分含量基本一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rottlerin可部分地抑制熱療誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞跨膜電位崩解，說明抑制PKC-δ裂解活化可抑制其誘發(fā)的跨膜電位崩解。

PKC-δ活化出現(xiàn)在凋亡信號(hào)途徑的早期，是線粒體凋亡途徑的上游事件。Caspase家族是凋亡途徑的主要執(zhí)行者，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，是線粒體凋亡途徑的下游事件。PKC-δ激活是Caspase-3活化所必需的，Rottlerin或PKC-δ突變可抑制PKC-δ的激活，從而抑制其誘發(fā)的Caspase-3的活化，PKC-δ是Caspase-3的上游因子并調(diào)節(jié)其活性[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性值比較，未加熱組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相同熱處理?xiàng)l件下，經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性值低于未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（P＜0.01）。表明Rottlerin可降低熱誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞中Caspase-3的活性。

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