賴仁發(fā) 趙清桐 劉湘寧 沈山

（暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔頜面外科，廣東 廣州 510632）

可注射型組織工程骨是利用初始狀態(tài)為液態(tài)的生物材料加入種子細(xì)胞或生長(zhǎng)因子復(fù)合后，動(dòng)態(tài)下注射入體內(nèi)骨缺損處，逐步固化，形成固態(tài)或凝膠的組織工程骨，以修復(fù)各類骨缺損[1-2]。本研究所選用的殼聚糖（chitosan，CS）/β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）初期凝膠狀結(jié)構(gòu)非常利于血管的長(zhǎng)入和骨組織再生，易于塑形，并能夠很好地復(fù)合種子細(xì)胞或生長(zhǎng)因子，發(fā)揮其緩釋作用，凝固后具有一定的生物力學(xué)強(qiáng)度，其降解速度較為緩慢，材料在完成支持結(jié)構(gòu)功能后能完全降解吸收，適應(yīng)了微創(chuàng)外科技術(shù)發(fā)展的要求，具有組織損傷小、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是在骨基質(zhì)中存在的一種骨誘導(dǎo)活性蛋白，以其高效成骨活性而獲公認(rèn)[3-4]。本研究將CS/β-TCP與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP）-2復(fù)合，在流動(dòng)狀態(tài)下注射進(jìn)兔下頜骨缺損模型中，觀察骨缺損修復(fù)情況，以期為臨床開發(fā)一種較為理想的可注射性骨替代材料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

液相CS溶液（脫乙酰度為93%，相對(duì)分子質(zhì)量為942 000）、固相β-TCP粉末（鈣磷比1.50，直徑50μm）（暨南大學(xué)理工學(xué)院材料與工程系提供），rhBMP-2（暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所研制）。將CS 0.3mL、β-TCP 2.2 g和rhBMP-2 0.5mg各12份獨(dú)立包裝，用照射劑量為2Gy的γ射線照射消毒之后備用。

24只成年新西蘭大白兔（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不限，選自同一批次，體重約2.0 kg，同一環(huán)境下飼養(yǎng)。

XU850數(shù)碼照相機(jī)（佳能公司，日本），X線牙片機(jī)（Trophy Trex公司，日本），Quin Plus熒光顯微鏡、SP1600硬組織切片機(jī)（Leica公司，德國(guó)），Lunar Prodigy骨密度儀（GE公司，美國(guó)），熒光染料（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2 方法

模型建立：用30 g·L-1戊巴比妥鈉0.03 g·kg-1沿兔耳緣靜脈注射，全身麻醉，正中聯(lián)合后1.5 cm沿下頜骨走行做2.0 cm長(zhǎng)弧形切口，在下頜骨下緣手術(shù)區(qū)肌層和骨膜下注射含腎上腺素的利多卡因2mL行浸潤(rùn)麻醉。切開雙側(cè)下頜骨下緣皮膚、皮下組織、肌肉和骨膜，用齒科低速慢鉆在雙側(cè)下頜骨體部形成15mm×6mm的全層缺損，保留下頜骨下緣，術(shù)中用生理鹽水降溫。

1.3 分組

將24只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)均分為4組，每組6只：實(shí)驗(yàn)組1，植入CS/β-TCP/rhBMP-2；實(shí)驗(yàn)組2，植入CS/β-TCP；對(duì)照組1，植入髂嵴處的自體骨；對(duì)照組2，不植入任何材料。術(shù)后創(chuàng)口用1號(hào)絲線進(jìn)行縫合，并分籠飼養(yǎng)。術(shù)后3 d肌注慶大霉素，每次4萬(wàn)單位，每天2次。手術(shù)傷口不需要拆線，任其自然脫落。

1.4 組織標(biāo)本觀察

術(shù)后2、4、8周，通過(guò)空氣栓塞法分批處死實(shí)驗(yàn)白兔，每組每批2只。流水冷卻條件下，在原骨缺損以外4mm范圍內(nèi)截取整塊骨標(biāo)本，置入10%甲醛溶液固定48 h。取術(shù)后2、4周的全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和術(shù)后8周的一半實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做常規(guī)脫鈣、石蠟包埋，制成厚3μm的切片，蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色后于50倍光學(xué)顯微鏡下觀察植入物與周圍骨組織的結(jié)合、新生骨基質(zhì)的生成和鈣化、血管和纖維組織、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、支架材料的降解吸收及其他異常情況。將每個(gè)蠟塊標(biāo)本間隔一定距離作連續(xù)縱向切片5片，HE染色后置于顯微鏡下觀察，每張切片取上、下、左、右、中5個(gè)視野，使用Leica DMRA2圖像分析軟件測(cè)量新生骨組織占測(cè)量框架的面積百分比[5]，5個(gè)視野新生骨組織面積百分比的平均值記為每張切片的新生骨面積比，再取5張切片的百分比值的平均值代表該組織塊的新生骨面積比。

1.5 活體熒光標(biāo)記

術(shù)后4周標(biāo)記Tetracyclin（Tc，黃色，25mg·kg-1），處死動(dòng)物之前2 d標(biāo)記Alizarin-complen（AE，紅色，30mg·kg-1），均注射于兔頸部皮下。術(shù)后8周，每組取另一半實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做不脫鈣切片，乙醇逐級(jí)脫水、脫脂，甲基丙烯酸甲脂包埋，切片厚度100μm，表面磨至光滑，置于熒光顯微鏡下觀察新生骨面積[6]。

1.6 骨密度測(cè)量

分別取術(shù)后2、4、8周各組的骨標(biāo)本，40 g·L-1甲醛磷酸緩沖液固定后，骨密度儀檢測(cè)骨缺損修復(fù)區(qū)骨礦鹽含量，以此探明成骨的質(zhì)量和成骨速度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所測(cè)數(shù)據(jù)在SPSS 14.0進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方差分析，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大體觀察

各組實(shí)驗(yàn)兔手術(shù)后當(dāng)天不活躍，進(jìn)食量少，糞便少；第2天創(chuàng)口紅腫明顯，但創(chuàng)面干燥，縫線尚在；第3天以后，腫脹漸消，活躍程度、進(jìn)食及排便基本正常。所有創(chuàng)口均Ⅰ期愈合，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 HE染色觀察

實(shí)驗(yàn)組1：術(shù)后2周骨修復(fù)區(qū)有局灶性骨組織形成，見新形成的骨基質(zhì)，成骨細(xì)胞環(huán)繞、聚集，細(xì)胞增生活躍；術(shù)后4周新生骨組織明顯，骨組織所占的面積增大，骨基質(zhì)鈣化比例上升，可見骨小梁結(jié)構(gòu)及大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞與小血管；術(shù)后8周可見成熟的骨小梁，內(nèi)部陷窩中有成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞分布，材料降解吸收明顯（圖1A）。實(shí)驗(yàn)組2：術(shù)后2周可見少量的骨基質(zhì)形成，細(xì)胞成分多，膠原纖維豐富，可見較大片材料脫鈣后的殘余物，材料占據(jù)區(qū)域周緣未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見成骨細(xì)胞環(huán)繞；術(shù)后4周缺損中央?yún)^(qū)的局灶性成骨、骨小梁樣結(jié)構(gòu)較少，材料部分降解，其周圍可見成骨細(xì)胞環(huán)繞，多核巨細(xì)胞吞噬材料顆?，F(xiàn)象較2周多；術(shù)后8周在近缺損壁處，可見小梁狀新骨。在缺損中央?yún)^(qū)，有局灶性骨組織形成，可見形成的骨基質(zhì)。材料占據(jù)區(qū)，材料已有部分降解吸收（圖1B）。

對(duì)照組1：術(shù)后8周可見成熟骨小梁連接成片，細(xì)胞成分相對(duì)減少，新生血管增多（圖1C）。

對(duì)照組2：術(shù)后8周時(shí)近缺損壁處新生骨小梁較少；缺損中央?yún)^(qū)，局灶性骨組織形成較少，可見大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（圖1D）。

不同組間骨形成面積存在顯著差異（P=0.000），實(shí)驗(yàn)組2（均數(shù)10.73%）與對(duì)照組2（均數(shù)10.35%）無(wú)明顯差異；實(shí)驗(yàn)組1（均數(shù)22.96%）與對(duì)照組1間（均數(shù)22.63%）也無(wú)顯著差異，且兩組均優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組2，新骨形成效果最佳。不同觀察時(shí)間之間存在顯著差異（P=0.000），隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨面積比例也隨之增高（表1）。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)骨形成面積百分比（%，±s）Tab 1 The area percentage of bone regeneration of each group at different time point（%，±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)骨形成面積百分比（%，±s）Tab 1 The area percentage of bone regeneration of each group at different time point（%，±s）

組別 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組1 13.18±2.99 19.95±4.58 35.75±4.37實(shí)驗(yàn)組2 4.55±1.10 5.78±0.65 20.08±2.96對(duì)照組1 13.05±3.15 21.03±2.85 33.80±7.08對(duì)照組2 4.18±1.22 7.53±0.88 19.35±2.33

2.3 熒光標(biāo)記圖像觀察

對(duì)術(shù)后8周的硬組織標(biāo)本進(jìn)行熒光觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組1的黃色熒光標(biāo)記面積大，紅色熒光面積很小，可見骨小梁結(jié)構(gòu)；而實(shí)驗(yàn)組2在近缺損壁處，可見小梁狀新骨，黃色和紅色熒光標(biāo)記面積范圍均較少（圖2）。

2.4 骨密度值測(cè)量

不同時(shí)間點(diǎn)的骨密度值測(cè)量結(jié)果見表2。骨密度值從大到小依次為對(duì)照組1、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對(duì)照組2。實(shí)驗(yàn)組1術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的骨密度值明顯優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組2，且與對(duì)照組1間無(wú)明顯差異。不同觀測(cè)時(shí)間之間也存在有顯著性差異，隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，骨密度也隨之增高。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組的骨密度值（g·cm-2，±s）Tab 2 Bone density value of each group at different time point（g·cm-2，±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組的骨密度值（g·cm-2，±s）Tab 2 Bone density value of each group at different time point（g·cm-2，±s）

組別 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組1 0.255±0.026 0.237±0.023 0.349±0.013實(shí)驗(yàn)組2 0.122±0.012 0.113±0.017 0.220±0.044對(duì)照組1 0.220±0.007 0.257±0.014 0.354±0.006對(duì)照組2 0.188±0.002 0.201±0.006 0.281±0.021

3 討論

隨著組織工程學(xué)的興起，利用組織工程的方法體外構(gòu)建人工骨以修復(fù)骨缺損成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)[7]。傳統(tǒng)固態(tài)組織工程骨難于滿足口腔頜面部不規(guī)則骨缺損的修復(fù)。隨著微創(chuàng)傷外科技術(shù)的發(fā)展，研制和應(yīng)用可注射性骨替代材料己成為一個(gè)重要的努力方向。注射方法具有損傷小、易操作、適應(yīng)證廣等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[8-9]。

低溫相TCP的化學(xué)性質(zhì)近似于羥磷灰石，鈣磷比近似為1.5，含有CaO和P2O52種成分的磷酸鈣陶瓷是構(gòu)成人體硬組織的重要無(wú)機(jī)物質(zhì)，植入人體后，其表面同人體組織可達(dá)到鍵的結(jié)合，達(dá)到完全親和。β-TCP在水溶液中的溶解度較羥磷灰石大，能緩慢被體液吸收。除此，β-TCP的降解能為新骨的形成提供更豐富的Ca、P，在體內(nèi)可通過(guò)新陳代謝途徑促進(jìn)新骨組織的生成，通過(guò)自身降解逐步被新生骨組織置換。本實(shí)驗(yàn)將固態(tài)的β-TCP和液態(tài)的CS共同作為rhBMP-2的復(fù)合載體，制成可注射人工骨。利用CS降解快的特性，復(fù)合材料的孔隙率逐漸提高，以加速新骨的長(zhǎng)入。其抗壓強(qiáng)度達(dá)到骨松質(zhì)的抗壓強(qiáng)度。β-TCP可作rhBMP-2支架的原因?yàn)椋簡(jiǎn)渭兊臍ぞ厶菫樗嵝?，pH值為3.0，骨形態(tài)發(fā)生蛋白在酸性條件下穩(wěn)定，當(dāng)pH>8.5時(shí)則易喪失活性[3]，按0.3mL CS和2.2 gβ-TCP比例混和5min后，pH值為6.5左右，經(jīng)檢測(cè)rhBMP-2活性良好，凝固過(guò)程中基本不產(chǎn)熱，溫度在室溫和人體正常溫度之間，不會(huì)產(chǎn)生過(guò)高的熱量導(dǎo)致rhBMP-2活性喪失；故復(fù)合rhBMP-2的時(shí)間選擇在材料混和5min后加入充分混勻；在室溫條件下，0.3mL CS和2.2 gβ-TCP比例混和后由液體到凝固時(shí)間約為20min，能夠滿足可注射組織工程骨支架的術(shù)中操作時(shí)間；凝固成型后為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有一定的細(xì)胞生長(zhǎng)空間，利于骨組織再生。

骨組織的生長(zhǎng)、改建和鈣化的研究方法很多，除常規(guī)的HE染色、X線觀察、骨密度測(cè)量等檢測(cè)方法外，熒光標(biāo)記法也可以提示鈣化過(guò)程的開始，并確認(rèn)新骨的形成，并且方法簡(jiǎn)單，標(biāo)記可靠。自1970年Olerud等[10]首創(chuàng)3色熒光標(biāo)記法以來(lái)，此法已在骨研究中得到廣泛的應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2不同時(shí)期熒光標(biāo)記的觀察進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，骨熒光標(biāo)記出現(xiàn)了明顯的差別，表明新骨的形成受到了影響。實(shí)驗(yàn)組1中的部分骨小梁黃色熒光標(biāo)記面積比實(shí)驗(yàn)組2中的大，表明術(shù)后4周在rhBMP-2誘導(dǎo)下新骨的形成比較快。2組的紅色熒光標(biāo)記面積都很小則表明術(shù)后8周時(shí)骨組織已趨向成熟，新骨的形成較慢。這也從另一個(gè)角度表明，rhBMP-2對(duì)頜骨發(fā)育存在一定的影響。

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