李會(huì)娟，樊均明，王保和，謝席勝，鄧 堯

(1核工業(yè)416醫(yī)院，成都610051;2四川大學(xué)華西醫(yī)院)

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的共同途徑［1］，已證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和增殖能力下降在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用［2］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)可作用于腎小管上皮細(xì)胞［3］，引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和增殖能力下降、腎小管萎縮，從而導(dǎo)致腎小管纖維化。2006年7月～2007年2月，我們觀察了人參皂甙Rg1(GRg1)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)凋亡及增殖的影響，現(xiàn)報(bào)告如下并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠近端第39～42代腎小管上皮NRK52E細(xì)胞株(澳大利亞Monash醫(yī)學(xué)中心)，MTT(Sigma 公司)，TGF-β1(PEPROTECH 公司)，G-Rg1(云南植物藥廠)，膠原I(Col-Ⅰ)、膠原III(Col-Ⅲ)及纖維粘連蛋白(FN)ELISA試劑盒(上海森雄生物技術(shù)公司)，酶標(biāo)分析儀(美國(guó) Bio-Rad 550)，紫外分光光度儀(Beckman DU640)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NRK52E細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)，含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1×104/m l細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl。細(xì)胞貼壁后分為五組，每組8個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組僅加入含血清的DMEM培養(yǎng)基;TGF-β1組及G-Rg1低、中、高劑量組均加入TGF-β1使終質(zhì)量濃度為5 ng/ml;G-Rg1低、中、高劑量組分別加入GRg1使終質(zhì)量濃度分別為10、20、40 ng/ml。將培養(yǎng)板移入孵箱中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)1、3、5 d時(shí)每孔加入MTT溶液5 mg/ml(10μl)，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，翻板法小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液;每孔加入75μl二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。

1.2.2 觀察項(xiàng)目 ①細(xì)胞增殖率:采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定培養(yǎng)1、3、5 d時(shí)490 nm波長(zhǎng)各孔吸光度值(A值)。②Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN水平:培養(yǎng)5 d時(shí)取出留存的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于包被反應(yīng)條每孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)標(biāo)本100μl，空白對(duì)照孔中加入稀釋液100μl，37℃孵育90 min。棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌各孔5次，拍干后每孔加酶標(biāo)抗體75μl，37℃孵育15～20 min。每孔加入終止液50μl。于酶標(biāo)儀450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零，直接測(cè)定各孔Col-Ⅰ，Col-Ⅲ和FN水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果以±s表示，采用多組單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)結(jié)果之間的關(guān)系采用Spearman直線相關(guān)進(jìn)行分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組細(xì)胞增殖率見(jiàn)表1，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN水平見(jiàn)表2。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率(n=8，A值，±s)

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率(n=8，A值，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與 TGF-β1組比較，△P ＜0.05

1 d 3 d 5 d TGF-β1組 2.072 ±0.05* 1.952 ±0.06* 1.956 ±0.00組別*G-Rg1 低劑量組 2.386 ±0.12＊△2.224 ±0.02＊△2.112 ±0.00＊△G-Rg1 中劑量組 2.537 ±0.06＊△2.415 ±0.01＊△2.397 ±0.01＊△G-Rg1 高劑量組 2.808 ±0.04＊△3.105 ±0.09＊△3.008 ±0.04＊△對(duì)照組 2.903 ±0.11△ 3.219 ±0.02△ 3.699 ±0.03△

表2 各組 Col-Ⅰ，Col-Ⅲ和 FN 水平(n=8，ng/m l， ± s)

表2 各組 Col-Ⅰ，Col-Ⅲ和 FN 水平(n=8，ng/m l， ± s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與 TGF-β1組比較，△P ＜0.05

FN組別 Col-Ⅰ Col-ⅢTGF-β1組 460.40 ±14.17* 47.31 ±2.69* 3 077.22 ± 57.80*G-Rg1 低劑量組 407.16 ±12.90＊△ 34.32 ±2.48＊△ 2 780.60 ± 90.41＊△G-Rg1 中劑量組 338.52 ±11.60＊△ 25.04 ±3.00＊△ 2 315.28 ± 77.78＊△G-Rg1 高劑量組 287.99 ±10.07＊△ 12.22 ±0.63＊△ 1 930.75 ± 37.67＊△對(duì)照組 219.08 ±10.00△ 9.47 ±1.21△ 1 202.60 ±122.55△

3 討論

腎間質(zhì)纖維化的病理表現(xiàn)主要為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積和小管萎縮，腎小管上皮細(xì)胞增殖能力下降和凋亡增加是其重要的發(fā)病機(jī)制［4］。已證實(shí)TGF-β1是引起腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子，可抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡［3］。

G-Rg1是三七總皂甙的主要有效單體成分。大量研究表明G-Rg1有擴(kuò)張腦血管、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)免疫、促智、抗衰老、抗氧化應(yīng)激、改善新陳代謝、抗肝臟纖維化等多種生物學(xué)活性［5］;可抑制梗阻腎小管上皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖［6］。本研究發(fā)現(xiàn)G-Rg1各劑量組細(xì)胞增殖率明顯高于TGF-β1組，隨G-Rg1劑量增加而升高;證實(shí)G-Rg1可抑制TGF-β1的作用，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖;對(duì)腎臟有保護(hù)作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性。研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β1組細(xì)胞上清液中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN水平明顯高于對(duì)照組，而不同劑量的G-Rg1干預(yù)后Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN水平降低。證實(shí) TGF-β1可促進(jìn) NRK52E 細(xì)胞分泌 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN，而G-Rg1可抑制其分泌;但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有報(bào)道，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)可以減弱TGF-β1對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN是否通過(guò)抑制IGF-1的這種保護(hù)作用引起細(xì)胞增殖能力下降，有待進(jìn)一步證實(shí)。

總之，G-Rg1可抑制TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞增殖能力降低的作用，從而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制ECM分泌有關(guān);G-Rg1可用于腎纖維化的治療。

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