戴 閩 程 明 張 斌 程細高

在骨發(fā)育和重建過程中，破骨細胞是唯一能導致骨的有機和無機部分都吸收的細胞。破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成之間的平衡是維持正常骨的生理學基礎。破骨細胞數(shù)量和活性的改變可導致多種代謝性骨病發(fā)生,一直是研究的熱點和重點。但破骨細胞的分離和純化技術(shù)一直困擾著人們。一種永生化的、能方便使用的破骨細胞前體細胞系對骨科相關疾病的研究意義重大。本實驗旨在研究RAW264.7細胞在重組細胞核因子κB受體活化因子配基（ligand of receptor activator of NF κB，RANKL）的誘導下生成有骨吸收能力的破骨細胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自Sigma公司，小鼠RANKL購自Peprotech公司，RAW264.7細胞株由江西省消化疾病研究重點實驗室饋贈，市售新鮮成年牛股骨皮質(zhì)（后肢，管狀骨，粉白色，堅韌，密度1.163 kg/m3）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細胞培養(yǎng) 將裝有RAW264.7細胞的冷凍管從液氮中取出后，快速37℃水浴，1 000 r/min離心3 min,棄上清，DMEM重懸，隔天換液。細胞長滿到70%～80%傳代或接種到孔板。用細胞刮輕柔地將貼壁的RAW264.7細胞刮下，輕柔吹打均勻后，取細胞懸液混勻新鮮培養(yǎng)基，細胞計數(shù)板計數(shù)。并以1.5×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)板，用倒置相差顯微鏡（Nikon）觀察細胞的形態(tài)特征。對細胞進行計數(shù)并記錄細胞生長曲線。

1.2.2 誘導破骨細胞形成及TRAP染色實驗 用玻璃刀將蓋玻片切成1 cm×1 cm大小，超聲清洗儀清洗，泡酸，清洗干凈后烤箱烤干，高壓消毒滅菌后備用。24孔板內(nèi)每孔放置準備好的骨片和玻片，以1.5×105/cm2的密度將RAW264.7細胞傳代于培養(yǎng)板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，每孔加入RANKL，并調(diào)節(jié)成終濃度為35 ng/L，隔天半量換液，并保持RANKL的終濃度為35 ng/L，觀察細胞形態(tài)特征變化。于培養(yǎng)第1、3、5、7天取每組4張蓋玻片和薄骨片按TRAP試劑盒說明書進行TRAP染色實驗。

1.2.3 骨吸收陷窩檢測 取新鮮成年牛后肢股骨皮質(zhì)，去除軟組織、骨膜，-80℃貯存。用全自動磨片機磨成厚50 μm，面積為1 cm×1 cm的骨片，全自動拋光機拋光兩面，超聲清洗儀清洗，75%乙醇浸泡24 h，紫外線照射消毒備用。取培養(yǎng)第7天的骨片采用2.5%戊二醛固定液固定5 min,于0.25 mol/L氫氧化銨中超聲清洗3次，5 min/次，70℃烘箱內(nèi)烘干48 h后，裝臺（粘膠）、表面真空離子噴金，掃描電子顯微鏡（日立S－570）下觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7細胞的一般生物學特征 復蘇成功的RAW264.7細胞生長較快，細胞生長曲線見圖1。

2.2 誘導形成破骨細胞的形態(tài)學觀察 正常的RAW264．7細胞大致類圓形并生有較長突觸，單核，極少數(shù)有2個核，加入RANKL的RAW264．7細胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，在培養(yǎng)的第3天開始出現(xiàn)少數(shù)多核巨細胞，見圖2。隨培養(yǎng)時間的延長多核巨細胞的數(shù)目逐漸增多。第7天后，RAW264．7誘導的破骨細胞數(shù)量達峰值，胞體較大，邊緣不整齊，周圍有刷狀緣（褶皺），有偽足，一般3～8個核。第9天開始部分破骨細胞出現(xiàn)胞體縮小，核固縮等凋亡現(xiàn)象。第12天破骨細胞數(shù)目明顯減少。

2.3 RAW 264.7誘導形成的破骨細胞TRAP染色結(jié)果 培養(yǎng)7 d后，TRAP染色陽性多核細胞（核≥3個），體積大（直徑約100 μm），鏡下細胞核蘇木素染成藍色，胞漿染成紅橙色，酸性磷酸酶活性部位呈紫紅色顆粒（TRAP陽性的特征性表現(xiàn)）,偽足清晰。破骨細胞的褶皺和TRAP陽性顆粒清晰可見，見圖3。

2.4 骨吸收陷窩的掃描電鏡結(jié)果 破骨細胞在骨片上的吸收陷窩呈圓形或橢圓形，邊界輪廓清晰，陷窩底部纖維腐蝕吸收的紋路清晰可見，見圖4。

3 討論

生物學松動是導致人工關節(jié)假體遠期失敗的主要原因。磨損顆粒作用于假體周圍組織產(chǎn)生炎性介質(zhì),誘使破骨細胞生成、活化，導致假體周圍骨溶解[1]。破骨細胞起源于造血干細胞，分裂成單核細胞巨噬細胞譜系細胞的前體細胞后，在多種基因調(diào)控的細胞因子直接或間接作用下增殖、分化為多核的成熟破骨細胞，然后活化成為功能性破骨細胞[2]。

RAW264.7細胞是小鼠源性破骨前體細胞，該細胞株最初來源于Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤。通過RANKL誘導RAW264.7細胞獲得成熟破骨細胞是一種較好的獲取破骨細胞的方法。曾有多種破骨前體細胞系（如FDCP、HL-60細胞、C7細胞和FLG29.1等）用于破骨細胞的研究[3]，但目前公認的唯一成系的破骨細胞前體細胞是RAW264.7[4]，該細胞可表達破骨細胞表型標志的基因,與破骨細胞的基因表達譜極其相似,且能形成骨吸收陷窩[5]。

RAW264.7不僅表達巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），還表達c-fms癌基因受體（c-fms receptor）和核因子 κB受體活化因子（RANK），這也解釋了RAW264.7只需要RANKL誘導就能生成破骨細胞的原因[3，6]。本實驗過程中發(fā)現(xiàn)，RANKL誘導的第7天左右破骨細胞達到高峰。RAW264.7細胞具有胰酶抵抗性，貼壁緊，在實驗中，筆者曾有用0.01%EDTA+0.25%胰酶，消化貼壁的RAW264.7細胞，經(jīng)過半小時仍未消化下來的經(jīng)歷，所以使用細胞刮的效果相對較好。有研究認為，傳代超過20代的RAW264.7將失去對RANKL誘導的反應而形成破骨細胞的能力[7]。但本實驗采用的RAW264.7細胞系從ATCC公司購入后至少傳了200代左右，證明超過20代的RAW264.7仍然保持了在RANKL的誘導下分化成為破骨細胞的能力。

雖然有破骨細胞分離培養(yǎng)法、骨髓誘導培養(yǎng)法、脾干細胞誘導培養(yǎng)法和骨巨細胞瘤破骨細胞樣細胞分離培養(yǎng)法等多種培養(yǎng)方法，但本實驗使用RANKL誘導RAW264.7細胞生成破骨細胞的方法優(yōu)勢明顯：（1）可用于廣泛研究且RAW264.7容易得到。（2）容易培養(yǎng)且由RAW264.7細胞誘導形成的破骨細胞均一性好。（3）對RANKL誘導敏感且誘導周期短。（4）形成的破骨細胞數(shù)量大，雜質(zhì)細胞種類少（不需要成骨細胞和基質(zhì)細胞），純度高。（5）避免了分離培養(yǎng)原代細胞的大量工作。（6）由RAW264.7細胞誘導形成的破骨細胞具有很好的骨吸收陷窩活性和目前能檢測到的破骨細胞特異性標志。

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