戴 閩 程 明 張 斌 程細(xì)高

在骨發(fā)育和重建過程中，破骨細(xì)胞是唯一能導(dǎo)致骨的有機(jī)和無機(jī)部分都吸收的細(xì)胞。破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成之間的平衡是維持正常骨的生理學(xué)基礎(chǔ)。破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的改變可導(dǎo)致多種代謝性骨病發(fā)生,一直是研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。但破骨細(xì)胞的分離和純化技術(shù)一直困擾著人們。一種永生化的、能方便使用的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞系對骨科相關(guān)疾病的研究意義重大。本實(shí)驗(yàn)旨在研究RAW264.7細(xì)胞在重組細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基（ligand of receptor activator of NF κB，RANKL）的誘導(dǎo)下生成有骨吸收能力的破骨細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自Sigma公司，小鼠RANKL購自Peprotech公司，RAW264.7細(xì)胞株由江西省消化疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈，市售新鮮成年牛股骨皮質(zhì)（后肢，管狀骨，粉白色，堅(jiān)韌，密度1.163 kg/m3）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) 將裝有RAW264.7細(xì)胞的冷凍管從液氮中取出后，快速37℃水浴，1 000 r/min離心3 min,棄上清，DMEM重懸，隔天換液。細(xì)胞長滿到70%～80%傳代或接種到孔板。用細(xì)胞刮輕柔地將貼壁的RAW264.7細(xì)胞刮下，輕柔吹打均勻后，取細(xì)胞懸液混勻新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。并以1.5×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)板，用倒置相差顯微鏡（Nikon）觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄細(xì)胞生長曲線。

1.2.2 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成及TRAP染色實(shí)驗(yàn) 用玻璃刀將蓋玻片切成1 cm×1 cm大小，超聲清洗儀清洗，泡酸，清洗干凈后烤箱烤干，高壓消毒滅菌后備用。24孔板內(nèi)每孔放置準(zhǔn)備好的骨片和玻片，以1.5×105/cm2的密度將RAW264.7細(xì)胞傳代于培養(yǎng)板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，每孔加入RANKL，并調(diào)節(jié)成終濃度為35 ng/L，隔天半量換液，并保持RANKL的終濃度為35 ng/L，觀察細(xì)胞形態(tài)特征變化。于培養(yǎng)第1、3、5、7天取每組4張蓋玻片和薄骨片按TRAP試劑盒說明書進(jìn)行TRAP染色實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 骨吸收陷窩檢測 取新鮮成年牛后肢股骨皮質(zhì)，去除軟組織、骨膜，-80℃貯存。用全自動磨片機(jī)磨成厚50 μm，面積為1 cm×1 cm的骨片，全自動拋光機(jī)拋光兩面，超聲清洗儀清洗，75%乙醇浸泡24 h，紫外線照射消毒備用。取培養(yǎng)第7天的骨片采用2.5%戊二醛固定液固定5 min,于0.25 mol/L氫氧化銨中超聲清洗3次，5 min/次，70℃烘箱內(nèi)烘干48 h后，裝臺（粘膠）、表面真空離子噴金，掃描電子顯微鏡（日立S－570）下觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7細(xì)胞的一般生物學(xué)特征 復(fù)蘇成功的RAW264.7細(xì)胞生長較快，細(xì)胞生長曲線見圖1。

2.2 誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 正常的RAW264．7細(xì)胞大致類圓形并生有較長突觸，單核，極少數(shù)有2個核，加入RANKL的RAW264．7細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，在培養(yǎng)的第3天開始出現(xiàn)少數(shù)多核巨細(xì)胞，見圖2。隨培養(yǎng)時間的延長多核巨細(xì)胞的數(shù)目逐漸增多。第7天后，RAW264．7誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)峰值，胞體較大，邊緣不整齊，周圍有刷狀緣（褶皺），有偽足，一般3～8個核。第9天開始部分破骨細(xì)胞出現(xiàn)胞體縮小，核固縮等凋亡現(xiàn)象。第12天破骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少。

2.3 RAW 264.7誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞TRAP染色結(jié)果 培養(yǎng)7 d后，TRAP染色陽性多核細(xì)胞（核≥3個），體積大（直徑約100 μm），鏡下細(xì)胞核蘇木素染成藍(lán)色，胞漿染成紅橙色，酸性磷酸酶活性部位呈紫紅色顆粒（TRAP陽性的特征性表現(xiàn)）,偽足清晰。破骨細(xì)胞的褶皺和TRAP陽性顆粒清晰可見，見圖3。

2.4 骨吸收陷窩的掃描電鏡結(jié)果 破骨細(xì)胞在骨片上的吸收陷窩呈圓形或橢圓形，邊界輪廓清晰，陷窩底部纖維腐蝕吸收的紋路清晰可見，見圖4。

3 討論

生物學(xué)松動是導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)假體遠(yuǎn)期失敗的主要原因。磨損顆粒作用于假體周圍組織產(chǎn)生炎性介質(zhì),誘使破骨細(xì)胞生成、活化，導(dǎo)致假體周圍骨溶解[1]。破骨細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，分裂成單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞的前體細(xì)胞后，在多種基因調(diào)控的細(xì)胞因子直接或間接作用下增殖、分化為多核的成熟破骨細(xì)胞，然后活化成為功能性破骨細(xì)胞[2]。

RAW264.7細(xì)胞是小鼠源性破骨前體細(xì)胞，該細(xì)胞株最初來源于Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤。通過RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞獲得成熟破骨細(xì)胞是一種較好的獲取破骨細(xì)胞的方法。曾有多種破骨前體細(xì)胞系（如FDCP、HL-60細(xì)胞、C7細(xì)胞和FLG29.1等）用于破骨細(xì)胞的研究[3]，但目前公認(rèn)的唯一成系的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞是RAW264.7[4]，該細(xì)胞可表達(dá)破骨細(xì)胞表型標(biāo)志的基因,與破骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜極其相似,且能形成骨吸收陷窩[5]。

RAW264.7不僅表達(dá)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），還表達(dá)c-fms癌基因受體（c-fms receptor）和核因子 κB受體活化因子（RANK），這也解釋了RAW264.7只需要RANKL誘導(dǎo)就能生成破骨細(xì)胞的原因[3，6]。本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，RANKL誘導(dǎo)的第7天左右破骨細(xì)胞達(dá)到高峰。RAW264.7細(xì)胞具有胰酶抵抗性，貼壁緊，在實(shí)驗(yàn)中，筆者曾有用0.01%EDTA+0.25%胰酶，消化貼壁的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)過半小時仍未消化下來的經(jīng)歷，所以使用細(xì)胞刮的效果相對較好。有研究認(rèn)為，傳代超過20代的RAW264.7將失去對RANKL誘導(dǎo)的反應(yīng)而形成破骨細(xì)胞的能力[7]。但本實(shí)驗(yàn)采用的RAW264.7細(xì)胞系從ATCC公司購入后至少傳了200代左右，證明超過20代的RAW264.7仍然保持了在RANKL的誘導(dǎo)下分化成為破骨細(xì)胞的能力。

雖然有破骨細(xì)胞分離培養(yǎng)法、骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)法、脾干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法和骨巨細(xì)胞瘤破骨細(xì)胞樣細(xì)胞分離培養(yǎng)法等多種培養(yǎng)方法，但本實(shí)驗(yàn)使用RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞生成破骨細(xì)胞的方法優(yōu)勢明顯：（1）可用于廣泛研究且RAW264.7容易得到。（2）容易培養(yǎng)且由RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞均一性好。（3）對RANKL誘導(dǎo)敏感且誘導(dǎo)周期短。（4）形成的破骨細(xì)胞數(shù)量大，雜質(zhì)細(xì)胞種類少（不需要成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞），純度高。（5）避免了分離培養(yǎng)原代細(xì)胞的大量工作。（6）由RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞具有很好的骨吸收陷窩活性和目前能檢測到的破骨細(xì)胞特異性標(biāo)志。

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