高 飛,黃慶暉,黃越玲,孫衛(wèi)文,戴麗軍,沈巖松,李敏雄,陳盛強,劉忠民

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病之一,是由多 種病因引起的慢性腦性疾病,以大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電所致的突然、反復和短暫的大腦功能障礙為特征。近年來研究表明,癲癇病灶處的能量、氧及血流量有相應的變化,特別是缺氧和缺血后再灌注損傷,可產(chǎn)生大量的氧自由基,并形成自由基連鎖反應。氧自由基能攻擊多不飽和脂肪酸 (PUFA)引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,生成大量的丙二醛 (MDA)及新的氧自由基等復雜產(chǎn)物,繼而引起細胞代謝和功能障礙,參與癲癇對腦的損傷[1-2]。與此同時,一氧化氮 (NO)通過介導谷氨酸(GLU)從突觸前膜釋放后,GLU作用于突觸后膜上的 GLU離子型受體——N-甲基 -D-天冬氨酸受體 (NMDAR),使Ca2+通道開放,Ca2+內(nèi)流,從而參與了癲癇點燃的過程。柴胡桂枝湯出自 《傷寒論》,是小柴胡湯和桂枝湯的合方,由柴胡、桂枝、黃芩、半夏、芍藥、生姜、大棗、甘草組成,屬于治療太陽和少陽并證的方劑,主要用于太陽少陽合并引起的發(fā)熱微惡寒、肢節(jié)煩痛、微嘔、心下支結等癥。隨著對柴胡桂枝湯研究的深入,大量文獻報道,柴胡桂枝湯可通過增強 γ-氨基丁酸 (GABA)介導的抑制作用,來調(diào)節(jié)腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量的平衡[3-4],以降低癲癇發(fā)作次數(shù);此外,柴胡桂枝湯具有穩(wěn)定細胞膜結構,抑制自由基的產(chǎn)生,從而起到抗氧化及延緩衰老的作用。為進一步探討柴胡桂枝湯的抗癲癇、抗氧化作用的機制,本實驗擬用 Fmr1基因敲除小鼠作為模型,觀察其用藥前后行為學改變及腦組織超氧化物歧化酶 (SOD)活性和 MDA、NO水平的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 柴胡桂枝湯揮發(fā)油,應用超臨界二氧化碳 (CO2)萃取技術從柴胡桂枝湯中提取,萃取釜壓力 20 MPa,溫度 30℃;解折釜Ⅰ壓力 12 MPa,溫度60℃;解折釜Ⅱ壓力 60 MPa,溫度 40℃。

1.2 實驗動物 Fmr1基因敲除型 (KO)純合子 (-/-)及其野生型 (WT)純合子 (+/+)FVB近交系小鼠,由荷蘭伊拉斯塔斯大學細胞生物學及遺傳學研究中心 Oostra BA教授惠贈,廣州醫(yī)學院實驗動物中心飼養(yǎng)及繁殖。實驗動物的操作及飼養(yǎng)均符合廣東省及廣州醫(yī)學院實驗動物管理飼養(yǎng)條例,遵循人道原則。

1.3 實驗試劑與儀器 (1)試劑:SOD、MDA、NO測定試劑盒 (南京建成生物工程研究所);(2)儀器:Bio-rid酶標儀、低速離心機、曠場分析箱。曠場分析箱的制作:用一塊黑色膠板做成一個邊長為 72 cm的正方形,用膠紙作線條分成 16個邊長為 18 cm的正方形,該板中心作一個邊長為 18 cm的正方形,在該板邊緣 2 cm處圍成一個邊長為 68 cm的正方形,從邊緣到中心小正方形依次命名為第一區(qū)、第二區(qū)、第三區(qū)、第四區(qū),第四區(qū)也叫中央?yún)^(qū)。再以該板為底面做成無蓋長方體 (72 cm×72 cm×60 cm)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物的基因型鑒定

1.4.1.1 PCR擴增的引物合成 針對Fmr1基因敲除型和野生型 FVB純系小鼠的基因型設計引物:引物 M2 5′-AGTCATGCTATGGATATCAG-3′和 N2 5′-TGGGCTCTATGGCTTCTGA-3′, 用于 檢測基因敲除小鼠 Fmr1中包含新霉素插入片段的等位基因片段 (擴增產(chǎn)物的大小約為 800 bp)。引物 S1 5′-GTGGTTAGCTAAAGTGAGGATGAT-3′和 S2 5′-CAGGTTTGTTGGGATTAACAGATC-3′,用于檢測野生型小鼠的 Fmr1等位基因的片段 (擴增產(chǎn)物的大小為 468 bp)。

1.4.1.2 DNA的提取和定量 (1)DNA的提取:取小鼠尾巴 1.5 cm裝在1.5 ml離心管中并編號,加 500μl蛋白酶 K溶解尾巴,溶解后加 500μl Tris平衡酚用震蕩機大力搖勻 30 s;離心 5 min(13 000 r/min);取上清液于另一離心管中并加 500μl氯仿異戊醇,用震蕩機大力搖勻 30 s;離心 5 min(13 000 r/min);取上清液于另一離心管中,加 40μl 3 mol/LNaAC(pH 5.2),再加 1 ml無水乙醇,用手搖勻,可見絮狀 DNA;離心 5 min(13 000 r/min);倒掉上清液保留離心管底部灰白色沉淀,加 1 ml 75%乙醇,用震蕩機大力搖勻 30 s;離心 5 min(13 000 r/min);倒掉上清液,晾干,加380μl TE溶液,保存在溫度為 55℃的溫箱里 5 min。(2)DNA的定量:取 2.5μl洗脫液稀釋 20倍后,加入比色杯,測定OD值。

1.4.1.3 PCR擴增 PCR反應總體積為30μl,含 DNA 100 ng、 TaqDNA聚合酶1.0 U、引物各 0.35μmol/L、dNTP 200 μmol/L、10×TaqBuffer 3 μl和雙蒸水。PCR擴增條件為:熱啟動,94℃預變性 5 min,然后以下列溫度和時間循環(huán) 30次:94℃30 s,65℃30 s,72℃1.5 min。末次循環(huán)后均于 72℃延伸 10 min,4℃保存。

1.4.1.4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳 分別取PCR擴增產(chǎn)物 8μl、10×Loading Buffer 1 μl在含 0.5 mg/L溴化乙錠的 1.5%瓊脂糖凝膠中以 100 V電泳后于凝膠成像儀中觀察拍照。

1.4.2 曠場實驗方法

1.4.2.1 分組 健康的 FVB小鼠分為KO空白組、KO用藥組;WT空白組、WT用藥組共 4組,每組 15只,普通級,雌雄兼用,體質(zhì)量 (15士 3)g,日齡為30 d。用藥組腹腔注射柴胡桂枝湯揮發(fā)油(1.7 ml/kg)。空白組腹腔注射植物油,注射方式、劑量以及觀察方法同用藥組。

1.4.2.2 曠場實驗 把制作好的曠場分析箱放在光線充足的地方,在底面放一塊透明玻璃,在其正上方安裝好攝像機,調(diào)整好錄像畫面;將出生 30 d的小鼠從曠場箱邊緣放入,讓其自由爬行,并記錄下小鼠在曠場中 5 min的行為表現(xiàn)。為防止小鼠在曠場中留下異味,干擾實驗結果,每實驗完一只小鼠用 75%乙醇將透明玻璃擦洗一遍。曠場分析 viewer軟件為德國BIOBSERVE公司產(chǎn)品。

1.4.3 腦組織的取材及腦組織勻漿的制作 給予做完曠場實驗的小鼠 15 min的鈴聲刺激,然后斷頭處死小鼠,迅速在冰塊上分別取出腦皮質(zhì)、海馬,準確稱重,經(jīng)預冷 0.9%氯化鈉溶液漂洗去血液,濾紙吸干,制成 10%的組織勻漿,離心取上清作為待檢測標本,用鄰苯三酚自氧化法檢測 SOD,TBA法測定 MDA,硝酸還原酶法測定 NO。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件處理,實驗結果用 (x±s)表示,組間比較采用 t檢驗。

2 結果

2.1 實驗動物模型檢測

2.1.1 實驗動物基因型鑒定 KO和 WT小鼠基因 PCR擴增結果如圖 1所示。以M2和 N2為引物,經(jīng) PCR在 KO小鼠擴增出約 800 bp的 DNA片斷;以 S1和 S2為引物,經(jīng) PCR在 WT小鼠擴增出約 468 bp的 DNA片斷。KO小鼠由于在 Fmr1基因第5個外顯子中插入了一個新霉素片斷,而阻斷了 468 bp DNA片斷的擴增,證實脆性 X綜合征小鼠模型 Fmr1基因缺陷。

2.1.2 Fmr1基因敲除小鼠行為學觀察KO小鼠多動,易激惹,同窩小鼠之間常斗毆,易發(fā)癲癇;雄鼠睪丸較大,繁殖力差。

2.2 柴胡桂枝湯揮發(fā)油對 WT和 KO小鼠曠場行為學影響 KO空白組與 WT空白組相比,KO小鼠運動的平均速度、總路程及進入各個區(qū)的次數(shù)均比 WT空白組小鼠大,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表 1)。無論是 WT小鼠還是 KO小鼠,用藥組小鼠運動的平均速度、總路程及進入各區(qū)的次數(shù)均減少,與相應的空白組比較,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表2、表 3)。

2.3 柴胡桂枝湯揮發(fā)油對 WT和 KO小鼠腦組織 SOD活力及 MDA和 NO水平的影響 WT用藥組小鼠的 SOD活力、MDA和 NO水平與 WT空白組小鼠比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表4);KO用藥組小鼠的 SOD活力、MDA和 NO水平與 KO空白組小鼠比較,差異亦均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表 5)。

表 1 WT空白組與 KO空白組小鼠的行為學指標比較 (x±s)Table 1 The comparison of mice behavior indicators between KO control group and WT control group

表 2 WT空白組與WT用藥組小鼠的行為學指標比較 (x±s)Table 2 The comparison of mice behavior indicators between WT control group and WT treatment group

表 3 KO空白組與KO用藥組小鼠的行為學指標比較 (x±s)Table 3 The comparison of mice behavior indicators between KO control group and KO treatment group

表 4 柴胡桂枝湯揮發(fā)油對 WT小鼠腦組織SOD活力及 MDA和 NO水平的影響 (x±s)Table 4 Influenceof bupleuriand ramuli cinnamomi decoction on the level of malondialdehyde,nitrogen monoxidum and superoxide dismutase in WT mice

圖 1 KO和 WT小鼠 Fmr1基因片斷 PCR擴增結果 (1.5%瓊脂糖凝膠電泳)Figur e 1 PCR analysis of DNA from a wild type mouse(lane 2),and a heterozygous female(lane 3),a mutant male(lane 4),a mutant female(lane 5).Primer S1 and S2 were used to detect the 468 bp fragment of the wild-type allele(lane4,5),and primer M2 and N2 wereused to detect the 800bp fragment of the konckout allele(lane 4,5).Lane 1 contains a size marker

表 5 柴胡桂枝湯揮發(fā)油對 KO小鼠腦組織SOD活力及 MDA和NO水平的影響 (x±s)Table 5 Influenceof bupleuriand ramuli cinnamomi decoction on the level of malondialdehyde,nitrogen monoxidum and superoxide dismutase in KO mice

3 討論

遺傳性智力低下是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中一類主要的疾病,脆性 X綜合征 (fragile X syndrome)是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一,其發(fā)病率男性約為 1/1 250,女性為 1/2 500,占非特異性智力低下的2%～6%,在 X連鎖智力低下中占 40%。由于 CCG重復序列擴增和繼發(fā)啟動子區(qū)域甲基化的 FMRI基因沉默,故患者缺少FMRI(fragile x gene)蛋白。Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的 FMRI蛋白,表現(xiàn)巨睪癥、記憶力缺失、行為異常和智力低下[5-6]。本研究采用了曠場分析的方法對30日齡的 Fmr1基因敲除小鼠的曠場行為進行觀察。曠場分析能對動物對新異環(huán)境的興奮性、適應性、探究、緊張、記憶等多種行為進行評價[7-8],為開展腦的發(fā)育及老化過程的研究提供了行為學實驗的參考依據(jù)。

Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的 FMRI蛋白,表現(xiàn)為多動,易激惹,同窩小鼠之間常斗毆,易發(fā)癲癇;雄鼠睪丸較大,繁殖力差。與此同時,由表 1結果可表明,KO空白組與 WT空白組相比,KO小鼠運動的平均速度、總路程及進入各個區(qū)的次數(shù)均比 WT空白組小鼠大,說明 KO小鼠的探索性、興奮性、運動性均比 WT小鼠要高,這與文獻報道相符。

NO是近年來生物學研究中備受關注的活性遞質(zhì)[9],NO壽命短,一經(jīng)形成便可被液體中的氧滅活成 NO-2及 NO-3,故NO-2+NO-3可以準確代表體內(nèi) NO水平,本實驗利用硝酸還原酶特異性地將 NO-3還原成 NO-2,然后用比色法測定 NO-2間接反映組織中 NO水平,該法靈敏、簡便、穩(wěn)定可靠。國內(nèi)外文獻報道,癲癇發(fā)作期 NO水平會增高,并且與癲癇發(fā)作的程度和時間成正比。癲癇發(fā)作時間越長,癲癇程度越高,NO水平越高。本實驗證實,無論是 WT小鼠還是 KO小鼠,用藥組較空白組腦組織中 NO水平顯著降低。說明柴胡桂枝湯揮發(fā)油對 NO的生成有一定的抑制作用。

與此同時,用藥組小鼠腦組織 MDA水平較空白組也顯著降低。MDA脂質(zhì)過氧化物與癲癇灶內(nèi)癇樣皮層電 (ECOG)活動的產(chǎn)生和發(fā)展有密切關系,具有很強的生物毒性。它是氧自由基攻擊細胞膜的產(chǎn)物,能間接反映細胞損傷的程度。

SOD是機體清除 MDA的關鍵酶,其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。它特異性催化超氧陰離子自由基(O2-)發(fā)生歧化反應,再經(jīng)過氧化氫酶(CAT)轉化成 H2O和 O2,從而消除了O2-的毒性作用,減少癲癇的發(fā)生[10]。本實驗中,用藥后的 KO和 WT小鼠的 SOD活力均較空白組顯著提高。由此可知,柴胡桂枝湯揮發(fā)油能有效清除自由基、阻止過氧化物生成,減少 NO的神經(jīng)毒性,具有保護腦細胞的作用。

當然,引起神經(jīng)元同步放電的因素是多方面的,目前單純使用自由基清除劑治療癲癇不能達到理想效果,尚需與抗癲癇藥物聯(lián)合應用。但通過本實驗可以預見,進一步探索癲癇發(fā)生的自由基病理機制,開發(fā)有效清除自由基的藥物具有廣闊的前景,并將為人類最終戰(zhàn)勝癲癇提供有力的幫助。

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