曲秀梅,雷力力,方 芳,李 冬,張志國(guó)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

丙戊酸鈉為一線廣譜抗癲癇藥物,因分子結(jié)構(gòu)中沒有能夠產(chǎn)生紫外光譜吸收的結(jié)構(gòu),用一般的 HPLC法難于直接測(cè)定,文獻(xiàn)報(bào)道多用毛細(xì)管氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法、熒光偏振免疫法等。目前應(yīng)用較多的是“柱前衍生化高效液相色譜法檢測(cè)丙戊酸鈉的血清含量”,為了開展丙戊酸鈉臨床血藥濃度監(jiān)測(cè),對(duì)文獻(xiàn)[1,2]報(bào)道的柱前衍生化-高效液相色譜檢測(cè)方法進(jìn)行了綜合,經(jīng)過改進(jìn)的方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確,可以投入臨床使用。

1 儀器及試劑

P230Ⅱ高效液相色譜儀(大連伊利特分析儀器儀器有限公司);XW-80渦旋混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司);島津AUW220D十萬分之一天平。

色譜純甲醇：天津凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);丙戊酸鈉對(duì)照品 (湖南省湘中制藥有限公司提供,含量：99.8%,批號(hào) 090405)環(huán)己烷羧酸 (美國(guó) Sigma公司 ,批號(hào)：08265PD,);ω-溴苯乙酮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)：20090212);其它試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2C18(4.6mm× 250mm,5μm);柱溫：30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：248nm;流動(dòng)相：甲醇：水 (75：25);流速：1.0mL˙min-1;進(jìn)樣量：15 μL。

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

精密稱取丙戊酸鈉對(duì)照品37.6mg,置50mL容量瓶中,用 0.2mol˙L-1氨水稀釋至刻度 (含丙戊酸鈉 0.752mg˙ mL-1),搖勻,作為丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取 50.2mg環(huán)己烷羧酸,置50mL容量瓶中 ,用 0.2mol˙L-1氨水溶解并稀釋至刻度,再精密量取該液5mL,置 25mL容量瓶中,0.2mol˙L-1氨水稀釋至刻度,搖勻,作為內(nèi)標(biāo)溶液(含環(huán)己烷羧酸 0.2008mg˙mL-1)。精密稱取125.4mg ω-溴苯乙酮,置25mL容量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻 ,作為衍生化試液 (含 ω-溴苯乙酮 5.016mg˙mL-1),放置于冰箱中保存。

2.3 樣品制備及衍生化

取 200μL血清置空白采血管中,加入 30μL內(nèi)標(biāo)溶液和20 μL丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 ,再加入 200 μL 1mol˙L-1的硫酸溶液,振搖混勻,然后加入4mL正己烷振搖萃取3min,靜置5min使充分分層,分離出上清液2mL于另一試管中,加入40μL衍生化試液和20μL三乙胺,漩渦混勻,于63℃水浴衍生 10min,然后在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干,立即取出,用甲醇0.3mL漩渦溶解 ,作為血清樣品溶液。

2.4 色譜行為

在本實(shí)驗(yàn)條件下,衍生試劑峰與丙戊酸鈉及內(nèi)標(biāo)衍生物能很好地分離,血清中無明顯干擾峰。內(nèi)標(biāo)衍生物保留時(shí)間為7.00min,丙戊酸鈉衍生物保留時(shí)間為10.90min。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按 2.3項(xiàng)下方法 ,分別制備 8份樣品溶液 ,丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶 液 加入 量 分別為：18.80、37.60、56.40、75.20、94.00、112.80、127.84、150.40 μg˙mL-1,按色譜條件分別進(jìn)樣 ,計(jì)算各自的標(biāo)準(zhǔn)濃度(Y)對(duì)其峰高與內(nèi)標(biāo)峰高比值(X)的線性回歸,其線性關(guān)系式為 Y= 86.852X+ 1.9179,r= 0.9988,線 性 范 圍 為 18.80μ g～ 150.40μg˙mL-1,定 量 下 限 為18.80 μg˙mL-1。

2.6 精密度及回收率試驗(yàn)

按 2.3項(xiàng)下方法,分別制備高中低三個(gè)濃度 (94.00、75.20、56.40 μg˙mL-1)血清樣品溶液各 5份 ,連續(xù)測(cè)定 3d,以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算其方法回收率及日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果 ±s)

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果 ±s)

日內(nèi)精密度(n=5)日間精密度(n=15)加入量μ g˙mL-1 檢出量μ g˙mL-1 回收率(%)RSD%檢出量μ g˙mL-1 回收率(%)RSD%94.00 89.99±2.41 95.73 2.68 93.25±0.38 99.51 8.49 75.20 75.02±7.05 99.76 9.40 73.79±3.43 98.13 4.65 56.40 56.24±1.37 99.72 2.44 57.65±3.39 102.22 5.89

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1 衍生物穩(wěn)定性試驗(yàn)

按 2.3制備高、中、低三個(gè)濃度 (94.00、75.20、56.40 μg˙ mL-1)的樣品溶液,分別于 0、24、48h時(shí)各進(jìn)樣 2次,以丙戊酸鈉與內(nèi)標(biāo)峰面積比值計(jì)算 RSD,各樣品 RSD為：0.82%;0.82%;1.30%。說明樣品在48h內(nèi)檢測(cè),結(jié)果穩(wěn)定。

2.7.2 含藥血清樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取 血 清 9mL ,分 為 高、中、低 (94.00、75.20、56.40 μg˙mL-1)3個(gè)濃度組,各組分別加入丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 375μL、300μL和 225μL,漩渦混勻 ,置冰箱冷藏 (2～ 10℃ )保存 ,然后于 0、5、10d分別取血清 200 μL各 5份 ,各加入 30μL內(nèi)標(biāo)溶液 ,從加入 200μL1mol˙L-1的硫酸溶液開始 ,按 2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液。取水200 μL,從加入30μL內(nèi)標(biāo)溶液開始按2.3項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液。按2.1色譜條件分別檢測(cè)對(duì)照品溶液和樣品溶液,記錄色譜圖。以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各樣品回收率和各濃度回收率的 RSD。結(jié)果,高、中、低三個(gè)濃度樣品回收率和 RSD分別為95.44±7.65,RSD=8.02%;93.92±3.37,RSD=3.59%;99.32±3.81,RSD=3.83%;說 明血清樣品置冰箱(2～ 10℃)冷藏保存,10d內(nèi)檢測(cè),結(jié)果穩(wěn)定。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

文獻(xiàn)[1～4]報(bào)道檢測(cè)波長(zhǎng)有 266、248、235和 254nm,本文作者在以甲醇為溶劑,丙戊酸鈉含量為0.752mg˙mL-1于200nm～280nm進(jìn)行紫外掃描,上述各個(gè)波長(zhǎng)處均有吸收,當(dāng)濃度減少為0.2mg˙mL-1時(shí),266nm波長(zhǎng)處吸收很小 ,其他波長(zhǎng)有吸收,隨著波長(zhǎng)減小,吸收度加大;當(dāng)以同一濃度(0.752mg˙mL-1)樣品 ,分別在 266、248、235和 254nm檢測(cè) ,丙戊酸鈉及環(huán)己烷羧酸峰高按248、254、235和266nm依次遞減,因而本文選擇248nm作為吸收波長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)。

3.2 提取衍生溶媒的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道提取衍生化溶媒有二氯甲烷[1]和正己烷[2],本文在用二氯甲烷作為溶媒,在248nm檢測(cè)時(shí),空白溶液在內(nèi)標(biāo)和丙戊酸鈉保留時(shí)間處有吸收峰出現(xiàn),改變流動(dòng)相比例不能使雜質(zhì)峰分開;在266nm處,空白、內(nèi)標(biāo)、丙戊酸鈉和樣品溶液均沒有吸收峰出現(xiàn),可能是檢測(cè)濃度較低所致。因而選用正己烷作為衍生化溶媒。

3.3 蒸干終點(diǎn)的確定

在接近蒸干時(shí),應(yīng)注意隨時(shí)觀察,發(fā)現(xiàn)已蒸干立即取出,否則將會(huì)出現(xiàn)環(huán)己烷羧酸峰減小,丙戊酸鈉峰加大現(xiàn)象。

3.4 計(jì)算方法的確定

內(nèi)標(biāo)法計(jì)算血清樣品濃度,可以用峰高或峰面積[5]計(jì)算,試驗(yàn)結(jié)果顯示以峰高計(jì)算樣品濃度較以峰面積計(jì)算樣品濃度準(zhǔn)確,穩(wěn)定,因而采用峰面積計(jì)算樣品含量。

3.5 衍生化試劑用量的確定

有報(bào)道[6]衍生化試劑用量為2.5～ 10倍,本試驗(yàn)用量為7.33倍,當(dāng)小于7.33倍時(shí),線性關(guān)系試驗(yàn)中的高濃度部分會(huì)出現(xiàn)非理想峰高和峰形,因而選用本實(shí)驗(yàn)用量。

[1]孫志宏,陽國(guó)平,裴奇,等.2種丙戊酸鈉片劑在人體內(nèi)的相對(duì)生物利用度研究 [J].中南藥學(xué),2009,7(6)：415

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[3]展翔,徐枚.高效液相色譜法測(cè)定人血清中丙戊酸鈉含量 [J].中國(guó)藥業(yè),2009,18(6)：25

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[5]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典 [M].2005年版二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005,28