張志國(guó),李 冬,方 芳

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平均為臨床常用的抗癲癇藥物,它們的治療窗均較窄,血清藥物濃度易受多種因素影響,個(gè)體差異較大,臨床需要個(gè)體化給藥,為了按國(guó)家要求開(kāi)展藥物血清濃度監(jiān)測(cè) ,我們對(duì)文獻(xiàn)[1～3]報(bào)道的檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證比較 ,在濃度,進(jìn)樣量等因素進(jìn)行修改后,最終確定了適合于本院應(yīng)用的檢測(cè)方法。

1 儀器及試劑

大連依利特 P230Ⅱ高效液相色譜儀,UV230Ⅱ紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器,EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站。色譜純甲醇：天津凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);苯巴比妥對(duì)照品,批號(hào)：9201、苯妥英鈉對(duì)照品,批號(hào)：100210-200401、卡馬西平對(duì)照品,批號(hào)：100142-199503,三種對(duì)照品均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;其它試劑為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的制備

精密稱(chēng)取苯巴比妥25mg和苯妥英鈉15mg,分別用甲醇溶解定容至 100mL(含苯巴比妥 0.25mg/mL,苯妥英鈉0.15mg/mL);取卡馬西平40mg,用甲醇溶解定容至 100mL,精密量取5mL,用甲醇定容至25mL(含卡馬西平0.08mg/mL),置4℃冰箱保存 ,作為標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。

2.2 樣品溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：于1.5mL具塞尖底塑料離心管中,加苯巴比妥貯備溶液20μL、苯妥英鈉貯備溶液 20μL、卡馬西平貯備溶液20μL,加甲醇至 720μL,旋渦振蕩 5min混勻 ,作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

加樣血清溶液的制備：采集健康人血液于無(wú)抗凝劑的真空管中,室溫放置30min,待血液凝固后,以 3500r/min離心15min,分離出空白血清,取該血清200μL置于1.5mL具塞尖底塑料離心管中,加入苯巴比妥、苯妥英鈉及卡馬西平貯備溶液各20 μL,加甲醇至720μL,旋渦振蕩5min,3500r/min離心5min,取上清液作為樣品溶液。

空白血清溶液的制備：按加樣血清溶液的制備方法制備不含藥品的空白血清溶液。

2.3 色譜行為

HYPERSIL C18色譜柱：(4.6mm× 250mm,5μm);流動(dòng)相：甲醇-水(47：53);流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：15μL。分別取血清溶液和空白血清溶液,按色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果如圖1。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜圖

加樣血清溶液色譜圖在與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處均有吸收峰出現(xiàn),空白血清溶液在與標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收峰相應(yīng)的保留時(shí)間處沒(méi)有吸收峰出現(xiàn),表明其他雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)沒(méi)有干擾。分離度、拖尾因子等均符合藥典[1]要求。

2.4 線性關(guān)系與最低檢測(cè)限

按照樣品溶液制備方法制備,分別以三種藥品標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液之一為內(nèi)標(biāo)測(cè)定其他兩種藥品,內(nèi)標(biāo)加入量均為20μL,各藥品標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液加入量分別為：苯巴比妥5.0～ 38.0 μL、苯妥英鈉 8.0～ 32.0 μL、卡馬西平 8.0～ 35.0 μL,按照色譜條件進(jìn)樣,在上述濃度范圍內(nèi),計(jì)算各自的標(biāo)準(zhǔn)濃度(Y)對(duì)其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(X)的線性回歸方程。以卡馬西平和苯妥英鈉為內(nèi)標(biāo),苯巴比妥為：Y= 13.817X+ 1.1401(r=0.9945),Y= 19.737X- 0.4667(r= 0.9973);以卡馬西平和苯巴比妥為內(nèi)標(biāo),苯妥英鈉為：Y= 10.737X+ 2.1512(r= 0.9939),Y= 26.427X+ 0.0045(r= 0.9991);以苯妥英鈉和苯巴比妥為內(nèi)標(biāo),卡馬西平為：Y= 10.822X-0.1443(r= 0.9945),Y= 14.584X+ 0.0961(r= 0.9984)。按本法檢測(cè),苯巴比妥最低檢測(cè)限為6.3225 μg/mL、苯妥英鈉最低檢測(cè)限為 6.084μ g/mL、卡馬西平最低檢測(cè)限為3.2056μg/mL。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別以卡馬西平、苯妥英鈉和苯巴比妥為內(nèi)標(biāo),加入量分別為相當(dāng)于血清含量8.014μ g/mL、15.21 μg/mL、25.29μg/mL。按樣品溶液配制方法分別配制含苯巴比妥 ,苯妥英鈉和卡馬西平高、中、低三種濃度的血清樣品;根據(jù)所得峰面積按公式[1]。

根據(jù)測(cè)定所得峰面積按公式[1]：

含量 CX=f(Cx樣品濃度、Ax樣品峰面積、Ac內(nèi)標(biāo)峰面積、Cc內(nèi)標(biāo)物濃度 )和各樣品 f值計(jì)算回收率 ,結(jié)果卡馬西平為內(nèi)標(biāo)本巴比妥和苯妥英鈉平均回收率為100.90%和100.50%;以苯妥英鈉為內(nèi)標(biāo)時(shí)苯巴比妥和卡馬西平平均回收率為99.81%和101.10%;以苯巴比妥為內(nèi)標(biāo)時(shí)苯妥英鈉和卡馬西平平均回收率為100.40%和101.40%。

2.6 精密度試驗(yàn)

取回收率試驗(yàn)高、中、低三種濃度的血清樣品各 3份,分別于同1d及3d內(nèi)按色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得平均日內(nèi)精密度為：苯巴比妥 RSD=0.84%、苯妥英鈉 RSD=0.93%、卡馬西平RSD=0.86%;平均日間精密度為：苯巴比妥 RSD=1.21%、苯妥英鈉 RSD=1.69%、卡馬西平 RSD=1.16%;表明本法重現(xiàn)性好,結(jié)果穩(wěn)定。

3 討論

流動(dòng)相試劑及比例參考文獻(xiàn)確定,甲醇用量增加或減少均會(huì)引起峰型變化,以現(xiàn)在比例峰型最好。樣品中加入空白血清后峰型好于加空白血清前。進(jìn)樣量按照試驗(yàn)實(shí)際確定,在進(jìn)樣 20μL時(shí)三種藥品均會(huì)出現(xiàn)雙頭峰,改為進(jìn)樣15μL后克服了此缺點(diǎn);提高進(jìn)樣藥品濃度不會(huì)引起峰型變化。對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物加入濃度按照血液中藥品有效濃度范圍[4]的中間濃度確定,低于報(bào)道[2]的檢測(cè)濃度。綜上所述,該方法試用于臨床血液中藥物濃度檢測(cè)具有可行性。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005,28

[2]杜青云,陳錦珊,黃惠麗.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定三種抗癲癇藥空白血清濃度[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2004,23(5)：334

[3]李影林.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書(shū) [M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1996,978

[4]陳新謙.新編藥物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2007,219,235