江清林,代淑華,胡少偉,黃 展,國(guó)玉芝,張?zhí)煊?辛 華

(1.佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007;2.黑龍江省農(nóng)墾第二醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154007)

高脂血癥又稱血脂異常和脂蛋白異常血癥,主要是由于脂肪代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常,使血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇升高,高密度脂蛋白膽固醇降低的血脂代謝紊亂性疾病,是常見(jiàn)的代謝和內(nèi)分泌疾病之一。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠 60只 ,雌雄各 半 ,體重 (180±20)g,鼠齡 9周 ,由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

中藥降脂1號(hào) 60毫升 /袋(含生藥 1g/mL),由佳木斯大學(xué)中醫(yī)藥研究所湯玉福教授提供,方劑主要由決明子、穿山龍、地骨皮等七味中藥組成;陽(yáng)性對(duì)照組藥物力平之(非諾貝特膠囊)200毫克 /粒,法國(guó)利博福尼制藥公司制造。

1.3 飼料

正常顆粒飼料的配制、高脂飼料配制、高脂乳劑配制參照江清林等方法[1]。

1.4 試劑與儀器

丙二醛試劑盒和超氧化物歧化酶試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。756紫外分光光度計(jì)(上海精密儀器廠),電子分析天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器廠),電熱恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠),TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器廠),DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司 ),可調(diào)式移液器 (浙江臨海市華威分析儀器廠),BI2000圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模制備

清潔級(jí) Wistar大鼠 60只,隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照組(12只)和高脂模型組(48只),正常對(duì)照組飼喂正常顆粒飼料,高脂模型組飼喂高脂飼料和采用高脂乳劑灌胃的方式促使大鼠血脂升高,實(shí)驗(yàn)至第18周末,高脂造模組大鼠中隨機(jī)抽取12只大鼠,眶靜脈采血,分離血清,測(cè)定血脂。結(jié)果表明高脂模型大鼠成功建立,可以進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組與給藥

在進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)時(shí) ,正常對(duì)照組大鼠12只,繼續(xù)飼喂普通飼料,每天予蒸餾水灌胃(1mL/100g體重 ),高脂模型組大鼠48只,按隨機(jī)原則分為4組,分別為：模型自然恢復(fù)組;中藥大劑量組;中藥小劑量組;西藥對(duì)照組。每組大鼠均給予普通飼料飼養(yǎng),其中,模型自然恢復(fù)組每天給予蒸餾水灌胃(1mL/100g體重 );參照《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)》方法[3],中藥低劑量組每天灌胃一次,劑量為0.6mL/100g,(相當(dāng)于按體重折算正常成人每日量6倍量);中藥高劑量組每天灌胃一次,每次劑量為1.2mL/100g,(相當(dāng)于按體重折算正常成人每日量12倍量);西藥對(duì)照組,將力平之以蒸餾水制成4mg/mL混懸液,每天灌胃一次,劑量為1mL/100g體重(按體重折算相當(dāng)于正常成人每日量12倍量)。共持續(xù)4周。

2.3 取材

給藥第 4周末,各組大鼠均禁食 16h,不禁水,于次日上午用乙醚全麻后,斷頭采血,取大鼠肝臟,用生理鹽水清洗,濾紙吸干多余水分,迅速摘取肝組織0.3g,加入預(yù)冷的生理鹽水,冰水中制成10%肝組織勻漿。另在肝臟最大葉距邊緣1cm處取肝組織,約5mm× 5mm大小,浸泡于 10%甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋,切片。

2.4 檢測(cè)方法

按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,黃嘌呤氧化酶法測(cè)定 SOD活力,TBA法測(cè)定 MDA濃度。切片進(jìn)行 HE染色,光鏡下觀察肝組織形態(tài)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

3 結(jié)果

見(jiàn)表 1。

表1 中藥降脂1號(hào)對(duì)高脂血癥大鼠肝臟 M DA的影響 (±s,n=12)

表1 中藥降脂1號(hào)對(duì)高脂血癥大鼠肝臟 M DA的影響 (±s,n=12)

各組與空白對(duì)照組比較,△ P ＜0.05,△△P＜0.01;各組與模型組組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

組 別 M DA(nmol/mgprot)SOD(U/mg)空百對(duì)照組 4.68±0.12 273.22±8.70模型組 8.74±0.74△△ 164.70±12.56△△中藥高劑量組 4.99±0.56** 233.13±10.58**中藥低劑量組 5.95±0.49** 196.16±6.47**力平之組 5.71±0.53** 238.58±8.44**

3.1 中藥降脂1號(hào)對(duì)高脂血癥大鼠肝臟 MDA的影響

模型組、中藥小劑量組、中藥大劑量組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組與空白對(duì)照組比較肝臟 MDA明顯升高 (P＜0.01),其中,中藥小劑量組、中藥大劑量組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組肝臟 MDA值均有不同程度的降低 (P＜0.01),以中藥大劑量組療效最好,各治療組組間比較無(wú)明顯差異 (P＞ 0.05)。

3.2 中藥降脂1號(hào)對(duì)高脂血癥大鼠肝臟 SOD的影響

模型組與空白對(duì)照組比較,模型組肝臟 SOD值明顯降低 (P＜0.05);而模型組與中藥小劑量組、中藥大劑量組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較肝臟 SOD值均有不同程度的升高(P＜0.01),其中,中藥大劑量組與陽(yáng)性藥物組升高較為明顯,療效接近,中藥大劑量組療效優(yōu)于中藥小劑量組。

3.3 各組大鼠肝臟組織學(xué)變化

3.3.1 空白對(duì)照組大鼠

見(jiàn)圖1。肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞排列整齊,肝竇清晰可見(jiàn),肝索排列整齊,肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。

圖1 正常組大鼠肝組織病理切片(HE,×200)

3.3.2 模型組大鼠

見(jiàn)圖2。肝組織重度脂肪變性,肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿脂肪油滴,肝細(xì)胞內(nèi)大脂滴將細(xì)胞核擠向一側(cè),肝竇縮小。

圖2 模型組大鼠肝組織病理切片(HE,×200)

3.3.3 中藥大劑量組

見(jiàn)圖 3。肝組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常,肝竇清晰可見(jiàn),肝索排列整齊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。

圖3 中藥大劑量組大鼠肝組織病理切片(HE,×200)

3.3.4 中藥小劑量組

見(jiàn)圖4。肝組織輕度脂肪變性,部分肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,肝細(xì)胞脹大變圓,形態(tài)不規(guī)則,肝索結(jié)構(gòu)尚存。

圖4 中藥小劑量組大鼠肝組織病理切片(HE,×200)

3.3.5 陽(yáng)性藥物對(duì)照組

見(jiàn)圖5。肝組織輕度脂肪變性,部分肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,肝細(xì)胞脹大,肝竇變窄,肝索結(jié)構(gòu)尚存。

圖5 西藥對(duì)照組大鼠肝組織病理切片(HE,×200)

4 討論

隨著人民生活水平的提高,脂肪肝發(fā)病率逐年上升,且有低齡化傾向。肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血癥等均是非酒精性脂肪肝的易感因素。因脂肪肝與高脂血癥關(guān)系密切,臨床上常用降脂藥物來(lái)治療脂肪肝,但一些降脂藥有可能會(huì)加重肝損傷,因此,開(kāi)發(fā)兼有降脂和保肝雙重作用的藥物會(huì)更有利于脂肪肝的防治。目前認(rèn)為,M DA在肝組織脂肪變和肝臟損傷方面起了十分重要的作用：MDA是過(guò)氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物,是常用的反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的指標(biāo)。M DA可作用于核轉(zhuǎn)錄因子к B(N F-кB),使致炎因子基因表達(dá)、釋放增強(qiáng),并啟動(dòng)黏附因子的轉(zhuǎn)錄,包括白細(xì)胞介素-8,細(xì)胞間黏附因子、腫瘤壞死因子-а(TN F-а)和選擇素 E等[2]。MDA的兩個(gè)功能基又可與線粒體的膜脂交聯(lián),使線粒體膜的流動(dòng)性明顯降低,干擾了脂肪酸的 β氧化[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí) ,中藥降脂1號(hào)可有效降低肝臟 M DA含量,因此可有效緩解肝損傷和肝組織脂肪變性。而 SOD是有效抗脂質(zhì)過(guò)氧化物酶,具有重要的防御自由基損傷作用,SOD是人體內(nèi)清除超氧陰離子的主要酶,它能催化超氧陰離子歧化為 H2和 O2,其活性大小與抗氧化能力呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠肝臟 M DA濃度顯著增加,而機(jī)體重要的自由基清除酶 SOD活性下降,表明模型組大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平增加,自由基清除能力下降 ,機(jī)體氧化、抗氧化狀態(tài)失衡,而大、小劑量組中藥均可顯著降低大鼠肝臟 MDA水平,提高 SOD活力,表明中藥降脂1號(hào)可增加大鼠肝臟抗氧化能力,降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平,減輕機(jī)體的氧化壓力。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看,與空白對(duì)照組相比,灌服大劑量中藥的大鼠肝臟形態(tài)基本恢復(fù)正常,肝竇清晰可見(jiàn),肝索排列整齊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,其效果明顯優(yōu)于力平之組,這說(shuō)明 ,中藥降脂 1號(hào)具有治療高脂飲食大鼠非酒精性脂肪肝的作用,可考慮進(jìn)行進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。

[1]江清林,季靜勇,辛華,等.中藥降脂1號(hào)對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(6)：38-39

[2]王夜明,曾秋棠,袁杰,等.氯沙坦抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及對(duì)核因子к BmRNA影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003,19(1)：44-47

[3]Mococei P,Cherubini A,Beal M F,et al.Altered mitochondrial membrance uidfl fluidity in AD brain[J].Neurasci Lett,1996,29(2)：129-135