楊福義,周 雷,楊文佳,楊 軍

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學2007級研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

缺血性腦血管疾病是目前高發(fā)的嚴重危害人類健康的主要神經系統(tǒng)疾病。流行病學研究表明,絕經前女性腦梗死的發(fā)生率低于同齡男性,絕經后其腦梗死發(fā)生率則明顯升高。大量的流行病學調查及動物實驗顯示,雌二醇(E2)具有減少腦梗死發(fā)作和削減梗死體積的作用,近年來,國內外學者對雌激素做了大量的實驗研究,但雌激素的腦保護機制仍未闡明。本文主要研究雌二醇對全腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)細胞的影響以及凋亡相關蛋白 Bcl-2/Bax的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

健康 雌性 Wistar大鼠,體重 200～ 230g,共 60只 ,佳 木斯大學實驗動物中心提供。主要試劑：Bax兔抗鼠單克隆抗體,Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體,二步法免疫組織化學檢測試劑,DAB顯色劑,(Tunel)原位細胞凋亡檢測,以上試劑均購于北京中杉金橋生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

A組(卵巢切除,但不全腦缺血再灌注)10只;B組(卵巢切除+全腦缺血再灌注)25只;C組(卵巢切除+全腦缺血再灌注+17-β雌二醇治療組)25只。其中 B組和 C組又隨機分為5個亞組,每組 5只大鼠,分別為缺血15min再灌注1h、6h、12h、24h、72h組。B、C組卵巢切除后 2周建立全腦缺血再灌注模型;C組切除雙側卵巢后每日給予腹腔注射17-β雌二醇(17β-E2)1mg/kg,共 14d,其余各組每天給予生理鹽水注射。

1.2.2 動物模型的建立

卵巢切除模型的制作：用10%水合氯醛腹腔麻醉,待動物麻醉完畢后于下腹部剃毛、消毒、鋪無菌巾。采用下腹部正中切口2.5～ 3cm,無菌條件下,用鑷子探入腹腔,夾取卵巢,結扎輸卵管,切除雙側卵巢,止血徹底后用慶大霉素腹腔注射,逐層縫合切口 ,放回籠中,待其恢復。全腦缺血再灌注模型的制作：大鼠腹腔注射10%水合氯醛,將大鼠俯臥,備皮,消毒。在枕骨下平行于脊柱沿頸背正中線切開皮膚和皮下肌肉直至第一頸椎,找到后弓上的翼突孔,按其解剖位置將燒灼的細針直接插入翼突孔 ,插入時間不宜過長,1～ 2s即可?？p合肌肉及皮膚。行頸部正中切口,于雙側頸動脈鞘處分離出雙側頸總動脈,待3h大鼠清醒后 ,用無創(chuàng)微血管夾夾閉雙側頸總動脈 ,阻斷血流 15min,造成腦缺血狀態(tài),然后放開血管夾,使腦血液循環(huán)恢復。預定時間取材。

1.2.3 標本制備

于再灌注時間點大鼠麻醉后,剪開腹壁 ,暴露心臟。用灌注穿刺針刺入左心室至主動脈根部,止血鉗固定。右心耳處剪一小口,用溫生理鹽水約 100mL灌注,再用4℃預冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖液約200mL灌注,斷頭取腦,于視交叉和乳頭體之間取2～ 3mm組織塊,固定于甲醛溶液中,自來水沖洗,酒精脫水,石蠟包埋、切片機做連續(xù)冠狀面切片。

1.2.4 免疫組化及 TUN EL法檢測

免疫組化法檢測 Bcl-2/Bax在雌性大鼠海馬 CA1區(qū)表達。Tunel法檢測其細胞凋亡數(shù)。

1.2.5 數(shù)據收集

于400倍光鏡下計數(shù)海馬 CA1區(qū)陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù),計算陽性細胞率 (陽性細胞率=陽性細胞數(shù) /總細胞數(shù)×100%)。每張切片計數(shù)4個不重疊視野,取平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據均以均數(shù)±標準差表示。采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,組間比較用方差分析。P ＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

見表 1。

表1 各組海馬區(qū) Bcl-2/Bax及 Tunel陽性細胞數(shù) ±s)

表1 各組海馬區(qū) Bcl-2/Bax及 Tunel陽性細胞數(shù) ±s)

Bcl-2組內比較：不同時間點 B組和 C組與 A組比較,A vs B1、B2、B3、B4、C2、C3、C4、C5(P ＜ 0.05)。同時間點 B組與 C組比較 ,B1vs C1,B2 v s C2,B5 vs C5(P ＜ 0.05)。 Bax組內比較：不同時間點 B組和 C組與 A組比較 ,A vs B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4、C5(P ＜0.05)。同時間點 B組與 C組比較,B4v s C4,B5vs c5(P＜0.05)。Tunel組內比較：不同時間點 B組和 C組與 A組比較,A v s B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2(P ＜ 0.05)。同時間點 B組與 C組比較,B1 vs C1,B2 vs C2,B3 vs C3,B4 vs C4,B5 v s C5(P ＜ 0.05)。

組別 Bcl-2 Bax Tunel A(對照組 ) 11.36±0.72 29.71±1.44 33.05±2.09 B1(缺血再灌注 1h) 8.21±0.87 17.52±1.57 37.15±1.23 B2(缺血再灌注 6h) 29.27±1.53 20.00±2.03 38.71±1.38 B3(缺血再灌注 12h) 34.32±0.99 21.84±1.45 42.11±1.15 B4(缺血再灌注 24h) 27.09±2.14 26.26±1.57 67.31±4.25 B5(缺血再灌注 72h) 11.44±1.44 31.60±1.91 52.55±2.27 C1(再灌 1h+ 雌二醇治療)12.96±0.89 16.24±2.78 23.68±1.66 C2(再灌 6h+ 雌二醇治療)41.96±2.30 19.04±1.23 17.77±2.16 C3(再灌 12h+ 雌二醇治療 )36.05±1.59 20.13±0.92 31.07±2.82 C4(再灌 24h+ 雌二醇治療 )31.77±2.45 21.15±1.68 38.73±7.44 C5(再灌 72h+ 雌二醇治療 )22.12±2.38 17.02±1.29 30.56±6.07

3 討論

凋亡是腦缺血后細胞死亡的主要形式。Bcl-2通過形成同源或異源二聚體與 Bax結合,抑制 cyto C的釋放及Caspase3、9的活化,從而拮抗凋亡。盡管細胞內 Bcl-2/Bax的比例是固定的,但在外界刺激或生理狀況異常時,同源或異源二聚體的量會發(fā)生變化。Bcl-2大量表達時,形成 Bcl-2同源二聚體,凋亡受到抑制;Bax大量表達時,則形成 Bax同源二聚體,細胞趨向凋亡。而當 Bcl-2與 Bax形成異源二聚體時,Bcl-2也可以發(fā)揮其抗凋亡活性。本實驗中雌二醇治療組在缺血再灌注1h、6h、72h點與對照組及腦缺血再灌注組相比 Bcl-2表達明顯增高。Bax在雌二醇治療組再灌注時間點24h、72h表達明顯降低。其中雌二醇治療組每個時間點的細胞凋亡數(shù)都低于同時間點缺血再灌注組。通過以上數(shù)據表明雌二醇很有可能是通過調節(jié) Bcl-2/Bax來抑制全腦缺血再灌注細胞凋亡,從而對腦細胞發(fā)揮保護作用。雌激素預處理能減輕腦缺血再灌注損傷的程度,但其作用機制還不十分清楚,可能是多因素的,與腦損傷部位、嚴重程度及循環(huán)中雌激素濃度等有關,涉及基因和非基因因素、血流和非血流調節(jié)機制、受體和非受體介導的機制。部分學者[1,2]認為通過非依賴的血流機制如抗過氧化作用、減少細胞內鈣蓄積、抑制 NMDA介導的神經興奮毒性損傷、提高神經營養(yǎng)因子受體表達、活化細胞分裂素活化蛋白激酶信號途徑、上凋抗凋亡基因 Bcl-2表達等發(fā)揮積極作用。還與抗炎、調節(jié)蛋白質合成、抑制細胞凋亡、維持局部缺血區(qū)的微血管血流供應有關,可能是雌激素與特定的雌激素受體結合后調節(jié)基因表達,對血管內皮細胞、平滑肌細胞、神經元及神經膠質細胞產生了遠期效應[3]。但雌二醇保護腦細胞免受損害的具體機制有待進一步研究。

[1]Dubal DB,Wise PM.Neuroprotectiv e effects of estradiol in middle aged female rats[J].Endocrinology,2001,142(1)：43-48

[2]Alkayed N J,Murphy SJ,Traystman RJ,et al.Neuroprotectiv e effects of female gonadal steroids in reproductively senescent female rats[J].Stroke,2000,31(1)：161-168

[3]Alonso de Lecinana M,Egido JA.Estrogens as neuroprotectants against ischemic stroke[J].Cerebrovasc Dis,2006,21(2)：48-53