邱慶連 ，潘清清，2，張友平，3，劉 問(wèn)，錢(qián) 冬*

（1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313000；2.浙江省三門(mén)縣海洋與漁業(yè)局，浙江三門(mén) 317100；3.浙江省紹興縣農(nóng)業(yè)局，浙江紹興 312000）

弧菌是海水養(yǎng)殖的主要病原菌，可引起海水養(yǎng)殖魚(yú)類、蝦蟹和貝類的多種疾病[1,2]，給海水養(yǎng)殖造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于弧菌病的控制，還是采用以抗生素為主的化學(xué)藥物治療方法，抗生素的使用造成了嚴(yán)重的菌株耐藥問(wèn)題，環(huán)境耐藥菌株的產(chǎn)生對(duì)人類健康造成了潛在的危害[3,4]。中草藥具有無(wú)抗藥性和藥物殘留、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，加上中草藥資源豐富，近年來(lái)在水生動(dòng)物病害控制方面日益受到人們的關(guān)注[5,6]。某些中草藥還有促進(jìn)機(jī)體生理代謝，提高機(jī)體抗病能力等作用[7]。

鋸緣青蟹俗稱青蟹，是浙江省重要的海水養(yǎng)殖蟹類。浙江省青蟹養(yǎng)殖年產(chǎn)量達(dá)到近3萬(wàn)t，占全國(guó)總產(chǎn)量1/3。近年來(lái)，沿海養(yǎng)殖鋸緣青蟹長(zhǎng)期受到病害的威脅。2006年青蟹全國(guó)平均發(fā)病率為13.77%，死亡率5.43%，全國(guó)青蟹因病害造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)2億余元[8]。研究表明，弧菌是鋸緣青蟹較為常見(jiàn)的分離菌株[9,10]，也是青蟹重要的繼發(fā)病原，是引起青蟹養(yǎng)殖死亡的重要原因之一。作者從三門(mén)發(fā)病青蟹中也分離到較多的菌株，部分菌株對(duì)青蟹有較強(qiáng)的致病力。為從中草藥來(lái)源中尋找可能的抗菌活性組份，減少抗生素等化學(xué)藥物的使用，作者研究了45種常用中草藥提取物對(duì)鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

擬態(tài)弧菌Vibrio mimicus SM060818、梅氏弧菌V.metschnikovii SM060813、霍利斯弧菌V.hollisae SM060913為本實(shí)驗(yàn)室分離自浙江三門(mén)發(fā)病鋸緣青蟹。

1.2 試驗(yàn)儀器、藥物和試劑

試驗(yàn)用離心機(jī)為Sigma 3K-15；藥物稱量精密電子天平為賽多利斯產(chǎn)品；細(xì)菌培養(yǎng)箱為上海精宏產(chǎn)品，細(xì)菌培養(yǎng)搖床為江蘇太倉(cāng)，高壓滅菌鍋為上海博迅公司產(chǎn)品。

試驗(yàn)用五倍子、川芎等45種中藥購(gòu)自湖州市慕韓齋藥堂，用中藥粉碎機(jī)充分粉碎后陰涼干燥處保存?zhèn)洹?/p>

抑菌試驗(yàn)用空白藥敏濾紙片及營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自杭州天和生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)基使用時(shí)添加1%NaCl，均高壓滅菌備用。

1.3 中草藥的制備

1.3.1 藥物水提取法[11]

取粉碎中藥5 g，加水至75 mL，4℃浸泡12 h后，煮沸后用文火煎煮30 min，濾出煎液，再加相同體積的水煎煮。合并3次煎煮液，加熱濃縮至7 mL，12 000 r/min離心10 min，取上清4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 藥物醇提取法

取粉碎中藥1 g，加5 mL 95%乙醇，浸泡，60℃水浴1 h，取上清4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 中草藥提取物的藥敏紙片制備[12]

分別取水提取法和醇提取法制備的藥液上清，取20 μL滴加于直徑6 mm的空白紙片上，50℃充分烘干備用。

1.5 中草藥提取物的抑菌測(cè)定

采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行[13]，實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)添加1%NaCl的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)28℃18 h后，取菌液100 μL加至1%NaCl的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用三角玻棒均勻涂布；將制備好的中草藥提取物藥敏紙片貼于涂布好菌液平板，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h；測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.6 中草藥提取物的最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

試驗(yàn)在添加1%NaCl的營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行，方法參照文獻(xiàn)[11]試管2倍稀釋法，本文采用96孔微量2倍稀釋法測(cè)定進(jìn)行:各個(gè)待測(cè)藥物設(shè)10個(gè)稀釋度,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)；每個(gè)培養(yǎng)孔中加入125 μL含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，隨后加入稀釋菌液25 μL濃度為6×106CFU/mL試驗(yàn)菌液，使最終菌濃度達(dá)到1×106CFU/mL；28℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，以完全抑制待測(cè)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為最低抑菌濃度（MIC）。

待測(cè)中草藥提取物的藥物濃度采用干燥稱重法確定，準(zhǔn)確量取1.00 mL中草藥提取物，加至1.5 mL離心管中，80℃烘箱烘干，稱干重。

2 結(jié)果

2.1 中草藥提取物對(duì)擬態(tài)弧菌抑菌活性

采用瓊脂平板紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)45種中草藥提取物對(duì)青蟹分離菌進(jìn)行的抑菌活性進(jìn)行了體外檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五倍子、烏梅、艾葉、天冬、秦皮、虎杖、知母等28種中草藥提取物都有一定的抑菌效果；千里光、穿心蓮等17種中藥提取物對(duì)分離菌株無(wú)抑制作用。分析水提取法和醇提取法成份的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)大部分中草藥在2種提取液中都可存在抑菌活性成份，以水提取法的活性高于醇提取法；青蒿的水提取物對(duì)擬態(tài)弧菌SM060818無(wú)明顯的抑菌活性，而醇提取物存在較強(qiáng)的抑菌活性（表1）。

表1 45種中草藥提取物對(duì)擬態(tài)弧菌的抑菌作用Tab.1 Antibacterial effect of 45 Chinese herbs extractions to Vibrio minicus

2.2 中草藥提取物對(duì)3種青蟹分離弧菌的抑菌活性

分析28種中草藥提取物對(duì)3種青蟹分離弧菌的抑菌活性，結(jié)果表明：五倍子、烏梅、秦皮、艾葉等提取物抑菌作用較好，對(duì)3種分離菌株均有較好的抑菌效果；天冬、白頭翁、赤芍、金銀花、黃精、黃柏、青蒿等中草藥僅對(duì)其中1～2個(gè)菌株有抑制作用(表2)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，擬態(tài)弧菌分離株SM060818對(duì)各類中藥提取物的抑菌靈敏度更好，霍利斯弧菌分離株SM060913相對(duì)不敏感，而梅氏弧菌的分離株SM060813則相對(duì)耐藥。表2為抑菌活性較強(qiáng)的22種中藥對(duì)3種弧菌分離株的抑菌試驗(yàn)結(jié)果。

表2 中草藥提取物對(duì)3種青蟹分離弧菌的抑菌活性Tab.2 Antibacterial effect of Chinese herb extractions to Vibrio isolates from Scylla serrata

2.3 中草藥提取物對(duì)青蟹致病弧菌的最小抑菌濃度（MIC）

從紙片擴(kuò)散試驗(yàn)中選取有較好抑菌效果的9種中草藥提取液，測(cè)定其對(duì)3種弧菌的最小抑菌濃度（MIC），結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，這些提取物中以五倍子提取物的抑菌效果最好，對(duì)擬態(tài)弧菌、梅氏弧菌和霍利斯弧菌等的MIC分別為0.172 mg/mL、0.172 mg/mL和0.086 mg/mL，其次是烏梅提取物，對(duì)3種弧菌的 MIC 分別為 0.461 mg/mL、0.461 mg/mL 和 0.922 mg/mL，其他提取物的 MIC 范圍在 1.04～167 mg不等（表3）。

表3 9種中草藥提取物對(duì)青蟹分離弧菌的最低抑菌濃度（mg/mL）Tab.3 The MIC of 9 Chinese herbs extraction to Vibrio isolates from S.serrata

3 討論

本文對(duì)45種中草藥，采用水煎煮法和乙醇法進(jìn)行了提取，用紙片擴(kuò)散法分析了45種中藥提取物對(duì)青蟹致病性弧菌進(jìn)行了抑菌測(cè)定，結(jié)果表明：試驗(yàn)的45種中藥提取物有28種中藥提取物對(duì)1種以上的青蟹致病弧菌表現(xiàn)出抑菌作用，其中五倍子、烏梅、秦皮、艾葉等各種提取物對(duì)擬態(tài)弧菌SM060818、梅氏弧菌SM060813、霍利斯弧菌SM060913等3種菌株均有較好抑菌作用；天冬、白頭翁、赤芍、金銀花、黃精、黃柏、青蒿等中草藥可對(duì)其中1～2種菌株有抑制作用。測(cè)定五倍子、烏梅、天冬等對(duì)致病弧菌的最低抑菌濃度(MIC)，其中五倍子和烏梅等藥物對(duì)擬態(tài)弧菌和梅氏弧菌的MIC分別為0.172 mg/mL、0.461 mg/mL，這些結(jié)果為抗弧菌中藥有效成份的研究提供了有益線索。

養(yǎng)殖青蟹近年來(lái)受到各類疾病的危害，白斑綜合征病毒(WSSV)、血卵渦鞭蟲(chóng)以及弧菌等感染占青蟹病害的大多數(shù)[14,15]，其中弧菌的分離有較多的報(bào)道[9,10]。從作者近年來(lái)對(duì)青蟹分離菌株種類和分布來(lái)看，傾向于認(rèn)為弧菌是青蟹重要的繼發(fā)病原，在環(huán)境脅迫或其他病原感染時(shí)加劇青蟹的發(fā)病死亡。尋找有抗弧菌活性中草藥，結(jié)合免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用，對(duì)提高青蟹病害控制水平將起到積極作用，還可避免減少單一使用抗菌藥引起的藥物次級(jí)污染等危害，在青蟹養(yǎng)殖中有重要的應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)，抗生素誘導(dǎo)的細(xì)菌耐藥性受到愈來(lái)愈多的關(guān)注[3,4]，抗生素的使用限制也日益嚴(yán)格，中草藥來(lái)源抗菌藥物的應(yīng)用將日益受到廣大研究者的關(guān)注。中藥和其他天然抗菌活性物質(zhì)是潛在新抗菌藥物的前導(dǎo)化合物，抗菌活性成份的化學(xué)特性研究受到廣泛的關(guān)注。就本研究測(cè)試的45種中藥而言，水煎煮法所提取抑菌成份明顯優(yōu)于醇提取法，說(shuō)明抑菌成份多為水性溶性成份，其特點(diǎn)為容易溶解和提取，但后期純化和結(jié)構(gòu)闡述較為困難，同時(shí)水煎煮法過(guò)程長(zhǎng)、能耗大，還存在不耐熱活性成份被破壞的風(fēng)險(xiǎn)，需要采用超聲波、微波等新提取技術(shù)。此外，從中藥提取物對(duì)弧菌的最低抑菌濃度（MIC）來(lái)看，效果最好的五倍子對(duì)弧菌MIC為0.172 mg/mL，抑菌效果大大低于目前常用抗菌藥物，這是由于中藥成份較為復(fù)雜，直接抗菌成份含量較少而致。許多中藥不同程度地存在免疫增強(qiáng)和機(jī)理調(diào)理等成份，不能以簡(jiǎn)單抑菌作用強(qiáng)弱來(lái)評(píng)價(jià)一種中藥提取物的藥用價(jià)值。通過(guò)加強(qiáng)對(duì)五倍子、烏梅等有較好抗菌力中藥活性成份提取和抑菌機(jī)理研究，對(duì)于尋找有潛力的抗菌化合物，有重要的應(yīng)用價(jià)值。

[1]吳后波,潘金培.病原弧菌的致病機(jī)理[J].水生生物學(xué)報(bào),2003,27(4)：422-426.

[2]楊少麗,王印庚,董樹(shù)剛.海水養(yǎng)殖魚(yú)類弧菌病的研究進(jìn)展[J].海洋水產(chǎn)研究,2005,26(4)：75-83.

[3]SON R,RUSUL G,SAHILAH A M,et al.Antibiotic resistance and plasmid profile of Aeromonas hydrophila isolates from cultured fish[J].Letters of Applied Microbiology,1997(24):479-482.

[4]LI J,YIE J,FOO R W T,et al.Antibiotic Resistance and Plasmid Profiles of Vibrio Isolates from Cultured Silver Sea Bream,Sparus sarba[J].Marine Pollution Bulletin,1999,39(1):245-249.

[5]張傳亮,李槿年,李小飛.擬態(tài)弧菌的致病性、耐藥性及中草藥防治弧菌病應(yīng)用[J].水利漁業(yè),2007,27(1)：96-98.

[6]王玉娥,邢晨光,王國(guó)良.5種海洋致病弧菌對(duì)34種中草藥敏感性的測(cè)定[J].水產(chǎn)科學(xué),2008,27(5)：221-225.

[7]喻運(yùn)珍,艾桃山,張萍香,等.53種中草藥對(duì)中華鱉主要致病菌的抑菌作用[J].漁業(yè)致富指南,1999（9）：45-47.

[8]農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局,全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站.2006年中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢測(cè)報(bào)告[R].2006：7-8.

[9]毛芝娟,卓華龍,楊季芳,等.鋸緣青蟹細(xì)菌性傳染病的病原菌研究[J].臺(tái)灣海峽,2001,20（2）：87-92.

[10]徐海圣,舒妙安,邵慶均,等.鋸緣青蟹常見(jiàn)病害及其防治技術(shù)[J].水產(chǎn)科學(xué),2000,19（5）：24-26.

[11]李少基,陳 武,陳足金.12種中草藥的體外抑菌試驗(yàn)[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2004（1）：44.

[12]侯永清,張 挺.不同提取工藝對(duì)中草藥抑菌效果的影響[J].飼料工業(yè),2003,24（2）：9-10.

[13]劉山輝.抗菌藥物的藥敏實(shí)驗(yàn)方法[J].吉林畜牧獸醫(yī),2003（12）：49-50.

[14]劉 問(wèn),錢(qián) 冬,潘清清，等.WSSV對(duì)鋸緣青蟹的致病性及血清酶指標(biāo)影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2009,33（6）：1 112-1 117.

[15]施 慧,許文軍,李鵬飛,等.應(yīng)用P C R方法檢測(cè)患“黃水病”鋸緣青蟹中的血卵渦鞭蟲(chóng)[J].海洋漁業(yè),2008,30(1)：74-79.