貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 (貴陽(yáng)550004)何 常 陳志英 李 珀 王菊芳 鐘 愉

WWOX基因是 2000年新發(fā)現(xiàn)的在普通型脆性位點(diǎn) FRA16D上的侯選抑癌基因,跨越了基因組內(nèi) STS markers D16s518和 D16s516的一個(gè)大于 100萬(wàn) bp的區(qū)域[1]。國(guó)外學(xué)者近年研究發(fā)現(xiàn)WWOX與Bax蛋白相互作用,共同參與了一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并與其生物學(xué)行為及預(yù)后有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化EnVision二步法檢測(cè)兩者在結(jié)直腸癌及結(jié)直腸炎癥中的表達(dá),探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及相互之間的可能關(guān)系。

材料及方法

1 標(biāo)本來(lái)源 收集貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1994～1998年間結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本共 368例,所有患者術(shù)前均未經(jīng)化學(xué)治療和放射治療。為了排除組織學(xué)類型及治療方法不同對(duì)預(yù)后的影響,我們選取了其中同一組織學(xué)類型(管狀腺癌 II級(jí))及相同治療方法(根治+化學(xué)治療)并有完整臨床隨訪資料的病例 58例,生存期的計(jì)算是從手術(shù)日期起到隨訪日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期,隨訪主要采用電話、門診及信訪方式獲得,隨訪率81%,失訪者和非癌死亡者未納入本組病例,本組 5年生存率 51.7%。本組中男性 28例,女性30例,年齡28～ 75歲;發(fā)生于升結(jié)腸11例、橫結(jié)腸10例、降結(jié)腸16例、直腸21例。同時(shí)收集同期腸鏡活檢結(jié)直腸炎癥標(biāo)本20例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚 4 μ m。

2 試劑及方法 WWOX兔抗人多克隆抗體購(gòu)至英國(guó)Abcom公司,工作濃度為1∶300,鼠抗人Bax單克隆抗體購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,工作濃度為 1∶300,PV-9000試劑盒購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。本試驗(yàn)采用EnVision二步法行免疫組化染色,操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行,每次染色均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。

3 結(jié)果判定 WWOX及 Bax陽(yáng)性均為細(xì)胞漿著色呈黃色,結(jié)果判定用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和著色程度兩相加權(quán)法,即每張切片觀察 10個(gè)高倍視野,每個(gè)高倍視野記數(shù) 100個(gè)細(xì)胞,其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 5%、＞5%～25%、26%～ 50%、＞ 50%時(shí)分別記 0、 1、2、3分;著色強(qiáng)度 (顏色)按未著色、淡黃色、棕黃色、黃褐色分別記0、1、2、 3分 ,兩項(xiàng)評(píng)分相加 ,總分 0～ 1分記為 (-),2分 記為 (+ ),3～ 4分記為 (++ ),5～ 6分記為 (+++)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,癌組織與對(duì)照組間蛋白表達(dá)的比較及癌組織中WWOX蛋白表達(dá)與臨床病理相關(guān)因素的關(guān)系用χ2檢驗(yàn),蛋白間相關(guān)性用χ2關(guān)聯(lián)性分析,P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 WWOX、Bax在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)結(jié)直腸癌組織中 WWOX、Bax的表達(dá)陽(yáng)性率分別為25.86%(15例),58.62%(34例);炎癥對(duì)照組中兩者的表達(dá)陽(yáng)性率分別為65%(13例),85%(17例).結(jié)果表明結(jié)直腸癌中 WWOX和 Bax蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,兩者間差異有顯著性(P＜0.01),見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌及結(jié)直腸炎癥中WWOX、Bax的表達(dá)

2 WOX、Bax的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 WWOX、Bax在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期無(wú)關(guān)(P＜0.05),與預(yù)后相關(guān),差異有顯著性(P＜0.01,P＜0.05),且WWOX的表達(dá)在癌組織的浸潤(rùn)深度間差異有顯著性(P＜0.05)。Bax的表達(dá)在癌組織的浸潤(rùn)深度間差異無(wú)顯著性(P＞0.05),見(jiàn)表 2。

表2 WWOX、Bax的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

3 結(jié)直腸癌組織中WWOX與Bax表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)χ2關(guān)聯(lián)性分析表明WWOX與 Bax的表達(dá)呈正相關(guān)(P ＜0.05)。

討 論

WWOX基因是 Bednarek等[1]在 2000年用霰彈法克隆鑒定得到的一個(gè)新的包含有 FRA16D(16q23.3-q24.1)的基因,并跨越了基因組內(nèi) STS markers D16s518和 D16s516的一個(gè)大于 100萬(wàn) bp的區(qū)域,這個(gè)區(qū)域位于染色體的 16q23.3-q24.1(普通型脆性位點(diǎn),FRA16D)。近年來(lái)大量的研究表明FHIT蛋白在大部分腫瘤中明顯降低,WWOX基因與對(duì)應(yīng)于常見(jiàn)染色體脆性位點(diǎn) FRA3B的 FHIT基因非常相象,并且它的表達(dá)異常也與多種腫瘤密切相關(guān),故被認(rèn)為是繼 FHIT基因之后的又一個(gè)新的抑癌基因。

目前人們通過(guò)研究已經(jīng)在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了WWOX的表達(dá)異常,而且主要是上皮組織的癌。 S-W Park等[2]報(bào)道與正常肝組織相比,在 18例肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中就有 13株的 WWOX蛋白表達(dá)減少甚至未表達(dá),提示W(wǎng)WOX基因與肝癌的發(fā)生可能有密切關(guān)系。Raim I.Aqeilan等[3]應(yīng)用免疫組化檢測(cè)了原發(fā)性胃癌中WWOX蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率僅為35%,明顯低于正常胃組織。另外在肺小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌等[4,5]組織中也發(fā)現(xiàn)了 WWOX蛋白的表達(dá)異常。本次試驗(yàn)中我們應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織及結(jié)直腸炎癥對(duì)照組中WWOX蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示W(wǎng)WOX在癌組織中的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,這與其他相關(guān)報(bào)道相符,提示W(wǎng)WOX蛋白的低表達(dá)可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起了重要作用。另外在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)WWOX在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與癌組織的浸潤(rùn)深度及患者的預(yù)后密切相關(guān)(P＜0.05,P＜0.01)。目前WWOX蛋白在人腫瘤中的詳細(xì)作用機(jī)制還不清楚,但有研究表明在鼠的體內(nèi),WWOX的類似物WOX1已被證實(shí)是 TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中必不可少的中介物。WOX1位于細(xì)胞的線粒體內(nèi),TNF通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜通透性的改變而導(dǎo)致WOX1從線粒體釋放,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。根據(jù)人和鼠間的高度同源性我們分析當(dāng)WWOX蛋白低表達(dá)甚至失活時(shí),影響了TNF的作用過(guò)程,從而降低或喪失對(duì)細(xì)胞凋亡的控制,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中扮演了重要的角色,是目前細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)之一。 Bax是 Bcl-2家族中最重要的促進(jìn)凋亡蛋白,定位于細(xì)胞漿,自身可形成同源二聚體或與Bcl-2形成異源二聚體。它廣泛分布于人體組織和細(xì)胞,尤其在肝臟、腎小管、胰島等表達(dá)較高。在多種腫瘤中,Bax表達(dá)下降。下調(diào)Bax能抑制多種因素誘導(dǎo)的多種腫瘤細(xì)胞凋亡,反之,上調(diào) Bax則促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。Koshida等檢測(cè)了82例胃癌,發(fā)現(xiàn) Bax陽(yáng)性者的凋亡指數(shù)明顯低于 Bax陰性者。Sarbia等[6]對(duì)食管癌的研究顯示 Bax在食管癌的表達(dá)明顯低于正常食管上皮,并且隨著腫瘤分化程度的下降而減低,Marx等[7]檢測(cè)了 215例卵巢癌的 Bax表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn) Bax的陽(yáng)性率為 47%,Bax陽(yáng)性者的預(yù)后不如Bax陰性者。我們的結(jié)果和其他報(bào)道相符,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn) Bax的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系密切,高表達(dá)預(yù)示患者的預(yù)后好,生存期長(zhǎng)。我們推測(cè)Bax基因的檢測(cè)對(duì)于結(jié)直腸癌的預(yù)后診斷有一定的參考意義。

WWOX的氨基末端有兩個(gè) WW結(jié)構(gòu)域,其主要是與蛋白之間相互作用有關(guān)[8],而蛋白之間的相互作用是機(jī)體抑癌基因通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)所必需的。有文獻(xiàn)報(bào)道了WWOX通過(guò)下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2和 Bcl-xl及上調(diào) P53的表達(dá)而增強(qiáng) TNF的細(xì)胞毒性功能,而 TNF通過(guò)促使線粒體通透性的改變而導(dǎo)致了WWOX從線粒體釋放入核內(nèi),起促凋亡的作用。Bax是 Bcl-2家族中最重要的促進(jìn)凋亡蛋白,此次研究發(fā)現(xiàn) WWOX與 Bax有協(xié)同作用 (P＜0.05),推測(cè)WWOX可能通過(guò)上調(diào) Bax的表達(dá)等一系列相同的作用方式促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此聯(lián)合檢測(cè)兩者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)可能對(duì)其預(yù)后的診斷有著積極的作用。

[1]劉 云,李雅麗,楊 俠.WWOX基因與腫瘤的研究 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2008,37(5):617-619.

[2]Park SW,Meyers JL,Zimonjic DB,et al.Frequent downregulation and loss of WWOX gene expression in human hepatocellular carcinoma[J].CancerResUK 2004,91:753-759.

[3]Aqeilan RI,Kuroki T,Pekarsky Y,et al.Loss of WWOX Expression in Gastric Carcinoma[J].Clinical Cancer Res,2004,10:3053-3058.

[4]周玉龍,徐永健,張珍祥.抑癌基因WWOX在肺腺癌細(xì)胞株 A549中表達(dá)的研究[J].中國(guó)癌癥雜志,2005,15(3):234-237.

[5]Kuroki T,Yendamuri S,Trapasso F,et al.The Tumor SuppressorGene WWOX atFRA16D Is Involved in Pancreatic Carcinogenesis[J].Clin Cancer Res,2004,10(7):2459-2465.

[6]Sarbia M,Bittinger F,Grabellus F,et al.Expression of Bax,a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family,in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer,1997,73(4):508-513.

[7]MarxD,BinderC,Meden H,et al.Differential expression of apoptosis associated genes bax and bcl-2 in ovarian cancer[J].Anticancer Res,1997,17(3C):2233-2240.

[8]Ludes-Meyers JH,Kil H,Bednarek AK,et al.WWOX binds the specific praline-rich ligand PPXY:identification of candidate interacting proteins[J].Oncogene,2004,23(29):5049-5055.