劉震 梁靚 竇鵬 卞寧生 柯曉康 章文偉

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 江蘇南京210093)

核酸酶酶解-高效液相色譜法分析DNA堿基組成*
——介紹一個綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)

劉震 梁靚 竇鵬 卞寧生 柯曉康 章文偉

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 江蘇南京210093)

介紹一個分析化學(xué)與生物化學(xué)交叉的綜合化學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)及其教學(xué)方案的設(shè)計(jì)思路。該實(shí)驗(yàn)以高效液相色譜和核酸酶為工具，分析DNA的堿基組成。通過改革實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)，加深學(xué)生對各個知識點(diǎn)的理解與運(yùn)用，培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力。

DNA由腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種堿基組成。G+C的含量在生物化學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義，不同生物體中的DNA具有特定的(C+G)%值，DNA的熔解溫度(Tm，PCR擴(kuò)增的重要參數(shù))和DNA的均一性都與(C+G)%值緊密相關(guān)。高效液相色譜(HPLC)是現(xiàn)代分析實(shí)驗(yàn)室必備的分析儀器;酶解反應(yīng)是生物化學(xué)以及生命科學(xué)研究中的重要工具。利用核酸酶酶解－高效液相色譜分析法［1］，可以對DNA的堿基組成進(jìn)行分析。該方法已經(jīng)相當(dāng)成熟［2］，并被國外教材采用為大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)［3］。但是，以往的實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕獜?qiáng)調(diào)用HPLC法測定DNA的堿基組成，并測定Tm值。本實(shí)驗(yàn)通過改革實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案與教學(xué)方式，對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行了創(chuàng)新設(shè)計(jì)，能夠加深學(xué)生對實(shí)驗(yàn)中各個知識點(diǎn)的理解與運(yùn)用，同時可培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力。

1 實(shí)驗(yàn)原理

(1)核酸酶P1能水解單鏈DNA或RNA的3'－5'磷酸二酯鍵，將其定量降解為4種核苷酸，化學(xué)反應(yīng)見圖1。但核酸酶P1不能水解雙鏈DNA。

(2)堿基配對原理:在DNA分子中，C通過氫鍵與G配對，A通過氫鍵與T配對。因此，C與G濃度相等，A與T濃度相等。

(3)將DNA的稀鹽溶液加熱到80～100℃，雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解體，變成兩條單鏈，這一過程稱為熱變性。DNA的變性發(fā)生在狹小的溫度范圍內(nèi)，是個相變過程。通常把加熱變性使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度，用Tm表示。DNA的Tm與其(G+C)含量成正比關(guān)系，(G+C)含量越高，Tm越高。這是因?yàn)镚與C配對時形成3個氫鍵，而A與T配對時只形成2個氫鍵。(G+C)%與Tm間存在一個經(jīng)驗(yàn)關(guān)系［4］:

(4)DNA的復(fù)性:在適當(dāng)?shù)臈l件下，變性后的DNA的兩條彼此分開的鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。經(jīng)過熱變性后的DNA，若緩慢冷卻，可以復(fù)性;但若在冰浴中驟然冷卻，則不能復(fù)性。

圖1 核酸酶P1催化核酸的水解反應(yīng)

(5)根據(jù)被測組分在流動相和固定相間相互作用強(qiáng)度的不同，可用HPLC將被測組分分離，與固定相相互作用弱的組分先流出色譜柱，與固定相相互作用強(qiáng)的組分后流出色譜柱。核苷酸的混合物可以采用離子交換色譜或反相色譜實(shí)現(xiàn)基線分離，本實(shí)驗(yàn)采用反相HPLC。

(6)以鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGMP，簡寫為G)為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)標(biāo)樣的峰面積利用歸一化法計(jì)算胞嘧啶脫氧核苷酸(dCMP，簡寫為C)，胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP，簡寫為T)，腺嘌呤脫氧核苷酸(dAMP，簡寫為A)的響應(yīng)因子(F):

式中，AC、AG、AA、AT分別為C、G、A和T的峰面積，［C］、［G］、［A］、［T］分別為C、G、A和T的濃度。根據(jù)酶解后的DNA樣品的峰面積和相應(yīng)的響應(yīng)因子可計(jì)算出C、T、A的濃度，并計(jì)算(C+G)的分?jǐn)?shù):

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

讓學(xué)生進(jìn)一步掌握高效液相色譜實(shí)際應(yīng)用、學(xué)習(xí)酶解的實(shí)際操作，培養(yǎng)學(xué)生應(yīng)用分析化學(xué)方法和生物化學(xué)知識解決實(shí)際問題的能力。

3 儀器與試劑

(1)高效液相色譜儀(紫外吸收檢測器，波長260nm)，反相色譜柱(C18)。

(2)恒溫水浴(室溫～100℃)。

(3)冰浴。

(4)未知DNA樣品:固體或1mg/mL水溶液(1mL)。

(5)核酸酶 P1:5units/mL溶于含0.5mmol/L ZnCl2的50mmol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.3)。

(6)核苷酸混合標(biāo)樣，含dGMP、dAMP、dCMP和dTMP各0.4mmol/L。

(7)核苷酸單一標(biāo)樣，分別含0.4mmol/L的dGMP、dAMP、dCMP或dTMP。

(8)流動相:含適量有機(jī)溶劑的10mmol/L磷酸鉀緩沖溶液，pH 7.2(有機(jī)溶劑的含量與色譜柱的品牌有關(guān)，一般為0～5%的甲醇或乙腈)。

4 實(shí)驗(yàn)要求

現(xiàn)有一未知DNA樣品(對學(xué)生是未知的)，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)介紹的生物化學(xué)知識和本實(shí)驗(yàn)提供的實(shí)驗(yàn)條件，自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，完成實(shí)驗(yàn)并回答下列問題，要求實(shí)驗(yàn)步驟數(shù)越少越好(運(yùn)行1次HPLC分析為1個步驟，平行實(shí)驗(yàn)視為1步):

(1)該樣品是單鏈DNA，雙鏈DNA，還是兩者的混合物?證據(jù)是什么?

(2)若該樣品中含有兩條單鏈DNA，如何證明這兩條單鏈?zhǔn)怯稍瓉砘パa(bǔ)的DNA雙鏈變性而來還是兩條不互補(bǔ)的單鏈DNA?

(3)測定該DNA樣品的(G+C)%，求算該DNA的溶解溫度(Tm)。

5 思考題

(1)計(jì)算相對濃度［C］/［G］、［T］/［G］和［A］/［G］。［C］/［G］的理論值應(yīng)為多少?［T］/［G］和［A］/［G］間的理論關(guān)系是什么?

(2)對于相同的DNA，利用單鏈和雙鏈測得的(G+C)含量相同嗎?為什么?

(3)注意觀察在不同條件下得到的色譜圖，比較色譜圖的變化，是否觀察到一些同你的預(yù)期不符合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果或現(xiàn)象?若有，如何解釋?

6 教學(xué)設(shè)計(jì)特點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)屬于分析化學(xué)與生物化學(xué)相結(jié)合的綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)，在教學(xué)設(shè)計(jì)上主要有以下特點(diǎn):

(1)教學(xué)內(nèi)容“問題化”，易激發(fā)學(xué)生的興趣，使學(xué)生積極參與，成為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的主體。通過對分析化學(xué)和生物化學(xué)相關(guān)知識的主動認(rèn)識與實(shí)際應(yīng)用，建立起真正屬于學(xué)生自己的知識，并培養(yǎng)學(xué)生應(yīng)用知識的能力。

(2)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由學(xué)生自己做主。學(xué)生在自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案時必須考慮實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中的每一個步驟。同時，通過分組討論的方式，讓學(xué)生相互評價各自的實(shí)驗(yàn)方案，最后由指導(dǎo)教師點(diǎn)評不同方案的共性、差異以及優(yōu)劣之處。在此基礎(chǔ)上，讓學(xué)生適當(dāng)更改，制定出最終的實(shí)驗(yàn)方案。在此過程中，指導(dǎo)教師只是點(diǎn)評、啟發(fā)與引導(dǎo)，并不要求學(xué)生的想法與教師完全一致。

(3)多個知識點(diǎn)的綜合運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)涉及到的知識點(diǎn)有:高效液相色譜法、歸一化法、核酸酶P1酶解原理、堿基配對原理、DNA的變性與復(fù)性、熔解溫度的估算等。在整個實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生需要多次綜合運(yùn)用這些知識點(diǎn)才能設(shè)計(jì)出合格的實(shí)驗(yàn)方案。在每一個實(shí)驗(yàn)步驟中，學(xué)生至少可以運(yùn)用到一個知識點(diǎn)，從而有效地培養(yǎng)了學(xué)生利用所學(xué)知識解決實(shí)際問題的能力。

(4)多角度、全方位的能力培養(yǎng)。單從HPLC的角度看，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容僅涉及到定性分析與定量分析。但在整個實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生的活動包括設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)、觀察、分析等多方面內(nèi)容。此外，學(xué)生還將學(xué)會統(tǒng)籌分配實(shí)驗(yàn)時間。

［1］ Katayama－Fujimura Y，Komatsu Y，Kuraishi H，et al.Agric Biol Chem，1984，48:3169

［2］ Wietstock SM.JChem Educ，1995，72:950

［3］ Harris D C.Quantitative Chemical Analysis.6th ed.New York:W.H.Freeman and Company，2002

［4］ 王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學(xué).第3版.北京:高等教育出版社，2002

國家自然科學(xué)基金委國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金“南京大學(xué)理科化學(xué)基地(J0630425)”