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(同濟(jì)大學(xué)化學(xué)系 上海200092)

氨基酸存在形式的分布及滴定法測(cè)定的可行性

張?jiān)?孟潔

(同濟(jì)大學(xué)化學(xué)系 上海200092)

討論水溶液中各類(lèi)氨基酸存在形式的分布及用傳統(tǒng)滴定分析法測(cè)定的可行性，用谷氨酸、精氨酸、組氨酸及絲氨酸驗(yàn)證了討論結(jié)果。結(jié)論:酸性氨基酸可以用堿滴定;堿性氨基酸可以用酸滴定;中性氨基酸既無(wú)法用堿滴定，也無(wú)法用酸滴定。

羧酸分子中烴基的一個(gè)或幾個(gè)氫原子被氨基取代的化合物稱作氨基酸［1］。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)水解的產(chǎn)物。氨基酸具有酸堿兩重性，其羧基可以提供質(zhì)子，氨基可以接受質(zhì)子，在水溶液中存在下述平衡:

氨基酸的上述3種存在形式分別稱作負(fù)離子、偶極離子及正離子，其中的偶極離子可以看作分子內(nèi)的羧基與氨基形成的內(nèi)鹽。在水溶液中，氨基酸主要以偶極離子的形式存在，而正離子和負(fù)離子的濃度都很低，且數(shù)量相等。此時(shí)，氨基酸水溶液的pH稱作等電點(diǎn)。若考慮酸堿性質(zhì)，可以將20種基本氨基酸分為酸性氨基酸、堿性氨基酸及中性氨基酸［1］。其中，谷氨酸和天冬氨酸屬于酸性氨基酸;精氨酸、賴氨酸及組氨酸屬于堿性氨基酸;除此之外的其余15種氨基酸屬于中性氨基酸。

氨基酸常用的測(cè)定方法是色譜法，如紙色譜、薄層色譜、離子交換色譜及高效液相色譜等［1］。此外，氨基酸的測(cè)定方法還有毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、熒光法、電化學(xué)分析法及非水滴定法等。相對(duì)于上述方法，傳統(tǒng)滴定分析法具有操作方便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。本文討論水溶液中各類(lèi)氨基酸存在形式的分布及用傳統(tǒng)滴定分析法測(cè)定的可行性，并對(duì)討論結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1 酸性氨基酸的分布及測(cè)定的可行性

1.1 酸性氨基酸各種存在形式的分布

酸性氨基酸在水溶液中可以有4種存在形式，分別記作H3A+(正離子)、H2A(偶極離子)、HA－(負(fù)離子)及A2－。其中，正離子H3A+可以看作三元酸;偶極離子H2A既可以看作二元酸，也可以看作一元堿;負(fù)離子HA－既可以看作一元酸，也可以看作二元堿;A2－可以看作三元堿。以谷氨酸為例，在等電點(diǎn)pH=3.22時(shí)，其正離子H3A、偶極離子H2AE、負(fù)離子HA及A的分布系數(shù)分別為0.079、0.843、0.079及0。上述分布系數(shù)說(shuō)明，在等電點(diǎn)時(shí)，谷氨酸雖然主要以偶極離子的形式存在(占84.3%)，但正離子和負(fù)離子仍占一定的比例(各占7.9%)。酸性氨基酸的α-羧基與其他位置的羧基中質(zhì)子的離解能力相近，其正離子的Ka1與Ka2相差不大，是引起這種現(xiàn)象的主要原因。

1.2 酸性氨基酸用堿滴定的可行性

將酸性氨基酸看作酸，討論其用堿滴定劑滴定的可行性。以谷氨酸為例，其正離子H3A(看作三元酸)的p Ka1、p Ka2及p Ka3分別為2.19、4.25及9.67，用堿滴定時(shí)，滴定曲線有一個(gè)突躍，滴定產(chǎn)物是負(fù)離子HA，滴定反應(yīng)是:

利用反應(yīng)式(1)，可以求出正離子H3A的濃度。谷氨酸的偶極離子H2AE(看作二元酸)的p Ka1和p Ka2分別為4.25和9.67，用堿滴定時(shí)，滴定曲線也有一個(gè)突躍，滴定產(chǎn)物也是負(fù)離子HA，滴定反應(yīng)是:

利用反應(yīng)式(2)，可以求出偶極離子H2AE的濃度。谷氨酸的負(fù)離子HA的p Ka為9.67，是一元極弱酸，用堿滴定時(shí)，滴定曲線沒(méi)有突躍，無(wú)法測(cè)出其濃度(有關(guān)酸堿直接滴定可行性的判據(jù)見(jiàn)文獻(xiàn)［2］)。

從上述討論可以得出結(jié)論:第一，谷氨酸的正離子H3A和偶極離子H2AE可以用堿滴定，而且滴定產(chǎn)物均是負(fù)離子HA;負(fù)離子HA無(wú)法用堿滴定。第二，由于谷氨酸的正離子H3A和偶極離子H2AE共存于溶液中，它們的滴定產(chǎn)物又均為負(fù)離子HA，反應(yīng)式(1)和(2)對(duì)應(yīng)的是同一個(gè)滴定終點(diǎn)。第三，根據(jù)反應(yīng)式(1)和(2)，有以下關(guān)系:

即在與OH－的反應(yīng)中，1個(gè)H3A相當(dāng)于2個(gè)H2AE。若以式(2)計(jì)量，對(duì)谷氨酸的偶極離子H2AE而言，測(cè)出的是其一倍濃度;對(duì)正離子H3A而言，測(cè)出的是其兩倍濃度;對(duì)谷氨酸的水溶液而言，測(cè)出的是其偶極離子H2AE的一倍濃度與正離子H3A的兩倍濃度之和。第四，在等電點(diǎn)時(shí)，谷氨酸的水溶液由偶極離子H2AE、正離子H3A及負(fù)離子HA3部分組成，而且正離子H3A的濃度又與負(fù)離子HA的濃度相等(各占7.9%)。因此，以式(2)計(jì)量，用堿滴定谷氨酸的水溶液，測(cè)出的既是偶極離子H2AE的一倍濃度與正離子H3A的兩倍濃度之和，又是偶極離子H2AE、正離子H3A及負(fù)離子HA濃度的總和，實(shí)際上也是谷氨酸的總濃度。

1.3 酸性氨基酸用酸滴定的可行性

將酸性氨基酸看作堿，討論其用酸滴定劑滴定的可行性。仍然以谷氨酸為例，其負(fù)離子HA的p Kb1和p Kb2分別為9.75和11.81，是二元極弱堿;偶極離子H2AE的p Kb為11.81，是一元極弱堿。用酸滴定谷氨酸的負(fù)離子HA或偶極離子H2AE時(shí)，它們的滴定曲線均沒(méi)有突躍，無(wú)法測(cè)出它們的濃度。雖然谷氨酸的A(看作三元堿)的p Kb1、p Kb2及p Kb3分別為4.33、9.75及11.81，用酸滴定時(shí)，滴定曲線有一個(gè)突躍，可以測(cè)出A的濃度，但在等電點(diǎn)時(shí)，在谷氨酸的水溶液中，A的分布系數(shù)為0，其濃度也為0，這種滴定沒(méi)有實(shí)際意義。

由于天冬氨酸的各級(jí)離解常數(shù)與谷氨酸相近，上述由谷氨酸得出的結(jié)論，同樣適用于天冬氨酸，實(shí)際上也適用于所有的酸性氨基酸。因此，按傳統(tǒng)滴定分析法的觀點(diǎn)，酸性氨基酸的水溶液可以用堿滴定劑滴定，但無(wú)法用酸滴定劑滴定。

2 堿性氨基酸的分布及測(cè)定的可行性

堿性氨基酸的分布及用傳統(tǒng)滴定分析法對(duì)其測(cè)定的可行性，與酸性氨基酸非常相似，用類(lèi)似于對(duì)酸性氨基酸的討論方法，可以對(duì)堿性氨基酸進(jìn)行討論。堿性氨基酸在水溶液中也可以有4種存在形式，分別記作H3A2+、H2A+(正離子)、HA(偶極離子)及A－(負(fù)離子)。在等電點(diǎn)時(shí)，雖然堿性氨基酸的正離子和負(fù)離子各占一定的比例，但其偶極離子仍是主要存在形式。用酸滴定劑滴定堿性氨基酸的水溶液，滴定曲線有一個(gè)突躍，利用下述滴定反應(yīng):

可以求出該氨基酸的總濃度。由于堿性氨基酸的偶極離子是極弱酸，無(wú)法用堿滴定劑滴定。因此，按傳統(tǒng)滴定分析法的觀點(diǎn)，堿性氨基酸的水溶液可以用酸滴定劑滴定，但無(wú)法用堿滴定劑滴定。

3 中性氨基酸的分布及測(cè)定的可行性

3.1 中性氨基酸各種存在形式的分布

中性氨基酸在水溶液中可以有3種存在形式(酪氨酸和半胱氨酸除外)，分別記作H2A+(正離子)、HA(偶極離子)及A－(負(fù)離子)，其中正離子H2A+可以看作二元酸;偶極離子HA既可以看作一元酸，也可以看作一元堿;負(fù)離子A－可以看作二元堿。以絲氨酸為例，在等電點(diǎn)pH=5.68時(shí)，其正離子H2A、偶極離子HAS及負(fù)離子A的分布系數(shù)分別為0、1.00及0。上述分布系數(shù)說(shuō)明，在水溶液中，絲氨酸雖然有3種存在形式，但在等電點(diǎn)時(shí)，其偶極離子HAS的形式占絕對(duì)多數(shù)，而正離子H2A+S和負(fù)離子A－S的形式接近于0。中性氨基酸的α-羧基與α-質(zhì)子化氨基中質(zhì)子的離解能力相差較大(即其正離子的Ka1與Ka2相差較大)，是引起這種現(xiàn)象的主要原因。在等電點(diǎn)時(shí)，其他中性氨基酸(酪氨酸和半胱氨酸除外)的各種存在形式的分布情況與絲氨酸相似。

3.2 中性氨基酸用堿或酸滴定的可行性

以絲氨酸為例，討論中性氨基酸用堿或酸滴定的可行性。將絲氨酸的偶極離子HAS看作酸，其p Ka為9.15，是一元極弱酸，用堿滴定時(shí)，滴定曲線沒(méi)有突躍，無(wú)法測(cè)出其濃度。將偶極離子HAS看作堿，其p Kb為11.79，是一元極弱堿，用酸滴定時(shí)，滴定曲線同樣沒(méi)有突躍，也無(wú)法測(cè)出其濃度。雖然絲氨酸的正離子H2A+S(看作二元酸)的p Ka1和p Ka2分別為2.21和9.15，可以用堿滴定;負(fù)離子AS(看作二元堿)的p Kb1和p Kb2分別為4.85和11.79，可以用酸滴定;但在等電點(diǎn)時(shí)，正離子H2A+S和負(fù)離子A－S的濃度均接近于0，這種滴定沒(méi)有實(shí)際意義。其他中性氨基酸(酪氨酸和半胱氨酸除外)的情況與絲氨酸相似。

此外，酪氨酸和半胱氨酸與其他中性氨基酸有所不同，在溶液中可以有4種存在形式，分別記作H3A+(正離子)、H2A(偶極離子)、HA－(負(fù)離子)及A2－。但由于這兩種酸的偶極離子H2A的p Ka1、p Ka2及p Kb均＞8，它們同樣無(wú)法用堿或酸滴定。

綜上所述，按傳統(tǒng)滴定分析法的觀點(diǎn)，中性氨基酸的水溶液既無(wú)法用堿滴定劑直接滴定，也無(wú)法用酸滴定劑直接滴定。

4 氨基酸測(cè)定可行性的驗(yàn)證

4.1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在100mL燒杯中，吸入10mL谷氨酸、精氨酸、組氨酸或絲氨酸溶液，加入5mL 1mol/L KNO3及35mL H2O，分別用0.01897mol/L NaOH或0.02163mol/L HCl自動(dòng)電位滴定，記錄滴定曲線(平行實(shí)驗(yàn)3次)。其中，氨基酸均為生化試劑，并經(jīng)105℃干燥至恒重。

4.2 驗(yàn)證結(jié)果

第一，用NaOH溶液滴定谷氨酸溶液的滴定曲線有突躍，谷氨酸的測(cè)定誤差為0.5%(表1);用HCl溶液滴定谷氨酸溶液的滴定曲線沒(méi)有突躍，無(wú)法測(cè)出谷氨酸的濃度。第二，用HCl溶液滴定精氨酸或組氨酸溶液的滴定曲線有突躍，精氨酸和組氨酸的測(cè)定誤差分別為0.7%和－0.5%(表1);用NaOH溶液滴定精氨酸或組氨酸溶液的滴定曲線沒(méi)有突躍，無(wú)法測(cè)出精氨酸或組氨酸的濃度。第三，用NaOH或HCl溶液滴定絲氨酸溶液的滴定曲線均沒(méi)有突躍，無(wú)法測(cè)出絲氨酸的濃度。第四，驗(yàn)證結(jié)果說(shuō)明，用傳統(tǒng)滴定分析法對(duì)各類(lèi)氨基酸的測(cè)定結(jié)果與上述理論討論所得出的結(jié)論一致。

表1 傳統(tǒng)滴定分析法對(duì)氨基酸測(cè)定可行性的驗(yàn)證結(jié)果

［1］ 趙文恩.生物化學(xué).北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004

［2］ 張?jiān)?分析化學(xué).上海:同濟(jì)大學(xué)出版社，2003

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