薛林貴 趙 旭 常思靜 張 紅 武振華 景春娥

1（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 蘭州 730070）

2（中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000）

聚β-羥基丁酸酯(PHB)是微生物細(xì)胞內(nèi)積累的一種貯能物質(zhì)，可由多種微生物在碳氮比失衡的情況下合成，它不僅具有類(lèi)似于塑料性質(zhì)，如可拉絲、成膜等，還具有生物相容性和生物降解性，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景[1]，但PHB的工業(yè)生產(chǎn)成本還遠(yuǎn)高于合成塑料。為此，國(guó)內(nèi)外在PHB生產(chǎn)研究中做了大量工作，其中，通過(guò)誘變篩選PHB高產(chǎn)菌株，是非常有效的降低成本途徑。常用的誘變方法主要有化學(xué)誘變和物理誘變，其中物理誘變的手段主要有紫外線(xiàn)、γ射線(xiàn)、X射線(xiàn)等低LET射線(xiàn)。重離子誘變是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新方法。重離子屬高LET輻射，其相對(duì)生物效應(yīng)比低LET輻射大得多，能產(chǎn)生較高的突變率和較寬的變異譜，有利于選育生物新品種[2]。重離子輻照有可能使一些其它方法很難取得誘變效果的工業(yè)微生物，發(fā)生有經(jīng)濟(jì)意義的突變，為工業(yè)微生物誘變育種開(kāi)辟新的途徑[3]。本實(shí)驗(yàn)在蘭州重離子加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的支持下，對(duì)PHB產(chǎn)生菌BacillusP-9進(jìn)行不同輻照強(qiáng)度的誘變篩選研究，取得了十分有意義的結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

芽孢桿菌(BacillusP-9)，由本校微生物工程研究室分離篩選獲得。

1.1.2 儀器

落射熒光顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司)，紫外分光光度儀 UV2100(尤尼柯儀器有限公司)，潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，高溫滅菌器DSX-280B(上海中安醫(yī)療器械廠(chǎng))等。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1) 斜面培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，甘油1.0，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

(2) 平板培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，甘油10.0，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

(3) 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，甘油 5.0，麥芽糖 5.0，pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)和PHB積累曲線(xiàn)

(1) 生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定：采用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)定[4]；

(2) PHB含量測(cè)定：采用硫酸法測(cè)定。濃硫酸在100℃加熱條件下會(huì)使PHB降解為巴豆酸，巴豆酸在235 nm紫外光譜區(qū)有吸收峰，通過(guò)紫外分光光度儀測(cè)定其吸收值，對(duì)照PHB標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算PHB含量。

1.2.2 菌懸液的制備

取兩環(huán)培養(yǎng)24 h的斜面培養(yǎng)物，接入50 mL種子培養(yǎng)基中，在溫度為29℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨時(shí)檢測(cè)菌液濃度，待菌液濃度達(dá)到108個(gè)?mL時(shí)，取2 mL菌懸液裝入Φ30 mm皿中備用。

1.2.3 重離子輻照

12C6+束由中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(HIRFL)產(chǎn)生，引出能量為80 MeV/u，LET為35.5 keV/mm，吸收劑量率約為1 Gy/min，用空氣電離室監(jiān)測(cè)劑量。樣品更換及劑量數(shù)據(jù)獲取由計(jì)算機(jī)控制，將裝有菌懸液的Φ30 mm皿固定于特制轉(zhuǎn)盤(pán)，用Φ40 mm重離子束斑垂直輻照，劑量分別為2.5、5、10、15、20 Gy，每個(gè)劑量做三個(gè)平行。

1.2.4 致死率測(cè)定

將處理過(guò)的菌懸液稀釋至105倍，吸取0.2 mL涂平板，根據(jù)長(zhǎng)出菌落的數(shù)量計(jì)算致死率。

1.2.5 誘變菌株初篩

將經(jīng)過(guò)輻照處理的菌液，稀釋至 105倍，吸取0.2 mL涂布在固體平板培養(yǎng)基上，使每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)量約為50個(gè)，每個(gè)劑量涂布20個(gè)平皿，共計(jì)菌落數(shù)約為1000個(gè)，在29℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h備用。尼羅藍(lán)是一種熒光染料，能特異性地對(duì)PHB進(jìn)行熒光染色。用尼羅藍(lán)溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，尼羅藍(lán)隨之滲入細(xì)胞，與胞內(nèi)的PHB顆粒結(jié)合，在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到細(xì)胞內(nèi)含有許多發(fā)橙黃色光的顆粒，這種顆粒即PHB，其大小、多少及發(fā)光強(qiáng)弱代表細(xì)胞中PHB的含量[5]。挑取培養(yǎng)好的菌落制成尼羅藍(lán)染色裝片，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，選取PHB顆粒較大、數(shù)量較多、熒光較強(qiáng)的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.6 誘變菌株復(fù)篩

根據(jù)初篩結(jié)果，從固體平板上挑取需要的單菌落接入試管斜面培養(yǎng)基，待長(zhǎng)滿(mǎn)后，分別取兩環(huán)接入50 mL液體種子培養(yǎng)基中，29℃搖瓶培養(yǎng)24 h，再以2%的接種量分別接入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，29℃搖瓶培養(yǎng)96 h。以細(xì)胞量和PHB含量為指標(biāo)，原始菌株為對(duì)照，每12 h取樣，測(cè)定細(xì)菌總量和PHB含量，繪制PHB含量曲線(xiàn)和生長(zhǎng)曲線(xiàn)，選出PHB含量較高的突變株檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7 穩(wěn)定性檢測(cè)

篩選出的菌株連續(xù)傳代 8次，測(cè)定每一代的PHB產(chǎn)量，比較其變化。

1.2.8 胞內(nèi)PHB顆粒成分分析

FT-VERTEX 70的全數(shù)字化紅外光譜儀[6]，德國(guó)Bruker公司；MERCURY 400 Plus的核磁共振儀[7]，美國(guó)Varian公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus P-9和G15菌生長(zhǎng)和PHB積累規(guī)律

采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每12 h取樣，測(cè)定細(xì)胞量和PHB的含量，重復(fù)三次取平均值，制作BacillusP-9和G15菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與PHB積累曲線(xiàn)(圖1)。結(jié)果表明，BacillusP-9菌株在接種后的前24 h處于延遲期，24 h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)開(kāi)始積累PHB，在84 h細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。穩(wěn)定生長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞量和PHB積累均為最大，即BacillusP-9的PHB積累與菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)是同步的，屬于一步發(fā)酵類(lèi)型[8]。108 h時(shí)BacillusP-9的細(xì)胞量為 2.408×108個(gè)/mL，PHB產(chǎn)量為1.25 g/L。對(duì)G15菌的生長(zhǎng)和PHB積累規(guī)律進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與P-9菌株相比較，該菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間明顯縮短，在培養(yǎng)72 h后即進(jìn)入穩(wěn)定期，PHB產(chǎn)量在培養(yǎng)60 h時(shí)達(dá)到最大，結(jié)果如圖2所示。

圖1 Bacillus P-9菌株(a)及其G15誘變菌(b)的生長(zhǎng)和PHB積累曲線(xiàn)Fig.1 Cell growth (□) and PHB production (■) curves of Bacillus P-9 strain (a) and the G15 mutant (b).

2.2 重離子輻照對(duì)菌株的影響

輻照劑量和致死率的關(guān)系(表1)表明，重離子輻照對(duì)BacillusP-9的致死率隨劑量增加，5 Gy以上劑量的致死率上升趨緩，20 Gy時(shí)致死率達(dá)97.44%。一般而言，致死率大于90%的照射劑量常用作誘變育種的參考劑量[9]。由表1，輻照劑量在10–20 Gy的范圍內(nèi)，BacillusP-9的致死率都大于90%，因此，突變菌株的篩選應(yīng)主要在此照射劑量范圍內(nèi)。

表1 重離子輻照對(duì)Bacillus P-9菌株生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of 80 MeV/u 12C6+ irradiation on growth of Bacillus P-9.

2.3 PHB高產(chǎn)菌株的篩選

2.3.1 PHB高產(chǎn)菌株的初篩

輻照菌液經(jīng)平板涂布培養(yǎng)后，根據(jù)菌落的大小、形狀進(jìn)行初步篩選，選出菌株用尼羅藍(lán)染色作熒光顯微鏡觀(guān)察，與原始菌株對(duì)比作進(jìn)一步篩選。約從5000株菌株中篩選出18株生長(zhǎng)與PHB積累較好的菌株，正突變率為 0.36%。由選出菌株的熒光照片(圖2)，篩選菌株的PHB顆粒明顯多于出發(fā)菌株，顆粒的熒光強(qiáng)度也顯著增強(qiáng)。選出菌株分別編號(hào)為G1、G2、G3、G4、…、G17、G18，接入斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

用搖瓶發(fā)酵法對(duì)原始菌株及上述 18株菌株進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的PHB含量，最終篩選出編號(hào)為G15的菌株，其PHB產(chǎn)量最高，為2.93 g/L，這是出發(fā)菌株的1.5倍。

2.3.3 G15菌株的遺傳穩(wěn)定性

G15菌株進(jìn)行穩(wěn)定性研究表明(表2)，連續(xù)傳代3次，其PHB積累量仍保持在94.2%。

圖2 熒光顯微鏡示菌體及PHB積累(1000×)Fig.2 Observation of the PHB accumulation under fluorescence microscope (1000×).

表2 G15遺傳穩(wěn)定性Table 2 The genetic stability of G15.

2.4 PHB定性分析

2.4.1 紅外光譜分析

G15菌株產(chǎn)生的 PHB樣品的紅外光譜與標(biāo)準(zhǔn)品的相似(圖3)。樣品在波數(shù)1723 cm處有一強(qiáng)烈峰值，此為羧酸中羰基(c=0)的吸收峰，3436 cm處存在 O-H 伸縮振動(dòng)，2976 cm–1、2935 cm–1、2874 cm–1處存在-CH3、-CH2、-CH振動(dòng)，這些都是 PHB的特征峰；此外在1058–1287 cm間存在大量C-O振動(dòng)，為聚酯的特征峰，紅外光譜測(cè)定結(jié)果說(shuō)明G15菌株胞內(nèi)積累的聚合物為PHB。

圖3 紅外吸收光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectroscopy.

2.4.2 核磁共振檢測(cè)

用核磁共振儀分析測(cè)定 PHB樣品的碳鏈骨架結(jié)構(gòu)，得到核磁共振碳譜，如圖4(A)所示。4個(gè)主吸收峰分別位于 19.75、40.76、67.59、169.14，它們分別是由聚合物中的4種不同微電環(huán)境：-CH3、-CH2、-CH和C=O中的碳原子所產(chǎn)生的，77附近處的吸收峰是由溶劑CDCl3中的碳原子引起的，這一結(jié)果與 Jiang等[10]報(bào)道的基本一致。核磁共振氫譜如圖4(B)所示，3個(gè)主吸收峰分別位于1.27、2.55和5.25，它們分別是由-CH3、-CH2和-CH中的氫原子震動(dòng)引起的，其中-CH2中H周?chē)碾娮迎h(huán)境相對(duì)較為復(fù)雜，所以產(chǎn)生了較多的分裂，形成了多重峰(2.45、2.46、2.49、2.50、2.58、2.60、2.62、2.64)，7.26處的吸收峰由溶劑 CDC13產(chǎn)生，這一結(jié)果與Quillaguaman等[11]報(bào)道的基本一致。核磁共振檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明胞內(nèi)聚合物為PHB。

圖4 核磁共振譜圖譜 A：13C，B：1HFig.4 Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.

3 討論

重離子輻照誘變技術(shù)應(yīng)用于微生物，微生物的突變率較高，性能改良的幅度較大，而且應(yīng)用方便、迅速、經(jīng)濟(jì)，所以被廣泛用于對(duì)多種生物的改良和優(yōu)化。隨著重離子輻照誘變技術(shù)在優(yōu)良性狀微生物菌種選育中的不斷應(yīng)用，已取得了豐碩成果。頡紅梅等[12]用40Ar離子輻照慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅小單孢菌，所得突變株的正變率為 69.1%。利用重離子輻照技術(shù)選育優(yōu)良性狀的之江菌素產(chǎn)生菌，獲得的新菌株比出發(fā)菌株效價(jià)提高75.3%[13]。我們利用重離子輻照技術(shù)對(duì)菌株BacillusP-9進(jìn)行誘變選育，結(jié)果表明，重離子輻照誘變顯著提高了供試菌株P(guān)HB的產(chǎn)量，其重離子的最佳誘變劑量為15 Gy，致死率在90%左右時(shí)誘變效果最佳，重離子輻照誘變育種效果顯著，具有廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景。

進(jìn)一步工作將用不同能量的離子束輻照處理菌株，研究其作用效果及機(jī)理，以指導(dǎo)設(shè)計(jì)最佳輻照誘變方案，達(dá)到更好的誘變效果，為進(jìn)一步開(kāi)展同類(lèi)工作提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)所用菌為芽胞桿菌屬菌株，其產(chǎn)生的 PHB沒(méi)有生物毒性[14]，可應(yīng)用于醫(yī)療工業(yè)中，具有良好的研究和應(yīng)用價(jià)值。期待進(jìn)一步研究G15菌株的遺傳穩(wěn)定性及發(fā)酵條件，進(jìn)行中試試驗(yàn)研究，盡快進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段。

1 于慧敏, 沈忠耀. 生物化工, 2001, 8: 11–16 YU Huimin, SHEN Zhongyao. Biochemical, 2001, 8:11–16

2 唐掌雄, 劉志芳, 施巾幗, 等. 核技術(shù), 2005, 28(1):30–33 TANG Zhangxiong, LIU Zhifang, SHI Jinguo,et al. Nucl Tech, 2005, 28(1): 30–33

3 李紅玉, 李成華, 丁新春, 等. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào), 2004, 22(1): 56–60 LI Hongyu, LI Chenghua, DING Xinchun,et al. J Radiat Res Radiat Process, 2004, 22(1): 56–60

4 楊 宇, 徐愛(ài)玲, 張燕飛, 等. 生命科學(xué)研究進(jìn)展, 2006,12(4): 62–67 YANG Yu, XU Ailing, ZHANG Yanfei,et al. Life Sci Res,2006, 12(4): 62–67

5 Anthony G, Holt J G. Appl Environ Microbiol, 1982,44(1): 238–241

6 徐 浩, 江慧修, 周慧玲, 等. 微生物學(xué)報(bào), 1991, 31(5):333–337 XU Hao, JIANG Huixiu, ZHOU Huilin,et al. Acto Microbiol Sin, 1991, 31(5): 333–337

7 徐愛(ài)玲, 歷 麗, 張 帥, 等. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 54(6): 707–712 XU Ailing, LI Li, ZHANG Shuai,et al. J Wuhan Univ(Nat Sci Ed.), 2008, 54(6): 707–712

8 Purushothanman M, Anderson R K L, Narayana S,et al.Bioprocess and Biosystems Eng, 2001, 24: 131–136

9 彭仁旺, 管考梅, 黃秀梨. 微生物學(xué)通報(bào), 1995, 22(4):197–199 PENG Renwang, GUAN Kaomei, HUANG Xiuli.Microbiol Tongbao, 1995, 22(4): 197–199

10 JIANG Yuji, SONG Xin, GONG Lei,et al. Enzyme and Microbial Technol, 2008, 42: 167–172

11 Jorge Quillaguaman, Osvaldo Delgado, Bo Mattiasson,et al. Enzyme and Microbial Technol, 2006, 38: 148–154

12 SANG Jinlong, ZHU Lihong. Bulletin of Science and Technology (in Chinese), 2002, 18(1): 63–66

13 XIE Hongmei, WEI Zengquan. Chin J Antibiotics (in Chinese), 1998, 23(6): 462–463

14 Valappil S P, Boccaccini A R, Bucke C,et al. Antonie Van Leeuwenhoek, 2007, 91: 1–17