趙旭晶,陰懷清,孫 玲,房清麗,武師潤,陰崇娟

圍生期缺氧缺血性腦損傷(hypoxia-ischem ia brain damage,H IBD)是新生兒死亡和兒童致殘的主要原因之一,臨床上對該病尚缺乏有效的治療。最近研究表明,亞低溫對缺氧缺血性腦損傷具有抗損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用,但其分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用Rice法制作H IBD模型,用免疫組化法測定假手術(shù)組、H IBD組、亞低溫組Caspase-3的表達(dá)變化,旨在探討亞低溫抗損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí),封閉群,7日齡W istar大鼠120只(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)雌雄不限,體重13 g±2 g。隨機(jī)分為3組,假手術(shù)組、H IBD組、亞低溫組。每組40只。每組根據(jù)處死時(shí)間不同又分為5個(gè)亞組:6 h組、12 h組、24 h組、48 h組、72 h組,每亞組各8只。

1.2 模型制作 參照Rice等[1]的方法制備H IBD模型。對照組為假手術(shù)動(dòng)物,只切開頸部皮膚分離出左頸總動(dòng)脈不結(jié)扎,縫合皮膚。

1.3 儀器及亞低溫實(shí)施 半導(dǎo)體可調(diào)恒溫水浴箱(由上海理工大學(xué)制冷工程研究所研制),動(dòng)物缺氧缺血結(jié)束后,立即將亞低溫組大鼠放入已接近半導(dǎo)體水浴箱水溫(25℃)的玻璃缸內(nèi),然后再將水溫設(shè)置到所需的溫度(30℃),30 m in左右水溫穩(wěn)定在30℃,并維持至治療結(jié)束;常溫組大鼠立即放入已預(yù)熱至34℃的暖箱中至治療結(jié)束。以缺氧缺血后即刻作為零點(diǎn),療程分別為6 h、12 h、24 h、48 h和72 h。

1.4 肛溫監(jiān)測及喂養(yǎng)方法 用溫度探針(OM EGA450AET,美國)測定肛溫(RT)。每只動(dòng)物每日進(jìn)奶量[2](m L)=0.412×體重(g)-0.299。每隔2h～3h進(jìn)奶1次,每次進(jìn)奶量為0.3 m L～0.5 m L。

1.5 取材及檢測 標(biāo)本留取,常規(guī)石蠟切片,二甲苯脫蠟,顯微鏡下觀察。各組均采用PV二步法檢測腦組織Caspase-3的表達(dá),一抗為兔抗大鼠Caspase-3抗體(1∶200);免疫組化二步法檢測試劑盒(PV 6001)。以上試劑均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)進(jìn)行圖像采集與分析。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織外觀 H IBD組24 h左腦出現(xiàn)不同程度的出血和萎縮,48 h左腦萎縮較24 h明顯,72 h左腦不同程度的萎縮更明顯,并出現(xiàn)不同程度液化壞死。亞低溫治療24 h組雙側(cè)腦組織大小正常,無明顯萎縮;48 h組左腦出現(xiàn)輕微水腫。治療組各時(shí)間點(diǎn)均無液化壞死。

2.2 病理學(xué)觀察 病理學(xué)研究顯示,H IBD組24 h、48 h神經(jīng)細(xì)胞壞死,胞體溶解,胞漿淡染,核固縮,72 h神經(jīng)元壞死明顯,膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯,病灶中心可見核固縮和核碎裂;亞低溫治療組各時(shí)間點(diǎn)病理變化均較HIBD組輕,細(xì)胞排列尚規(guī)則,形態(tài)較正常,核居中,核仁尚清楚,僅見斑點(diǎn)狀神經(jīng)元變性、壞死。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察 Caspase-3相關(guān)抗原以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。假手術(shù)組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外,胞核和胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。H IBD組于H IBD后24 h及48 h陽性表達(dá)較多,72 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)減少;亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)減少,主要表達(dá)于大腦皮層神經(jīng)元,膠質(zhì)細(xì)胞和海馬錐體細(xì)胞,與H IBD組各時(shí)間點(diǎn)相比,表達(dá)均明顯減少(P＜0.01)。同一時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組,組間Caspase-3表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織Caspase-3陽性細(xì)胞灰度值的變化(±s)

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織Caspase-3陽性細(xì)胞灰度值的變化(±s)

組別n 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h假手術(shù)組40 172.540±3.164 171.792±3.252 170.690±3.340 171.152±4.469 171.623±3.350 HIBD組40 158.583±3.0011)2)153.097±3.9971)2)144.140±4.5001)2)141.041±3.7091)2)150.986±3.9001)2)亞低溫組40 166.259±4.5621)160.849±4.8791)152.320±4.1731)152.056±3.8021)158.399±5.1221)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;同一時(shí)間點(diǎn)H IBD組與亞低溫治療組比較,2)P＜0.01

3 討 論

自1995年Hill等[3]首次證明乳鼠腦缺氧缺血后存在細(xì)胞凋亡后,越來越多的證據(jù)表明凋亡在腦損傷病理生理過程中發(fā)揮重要著作用[4-7]。缺血性腦損傷所致的細(xì)胞凋亡可分3個(gè)階段:信號(hào)傳遞階段、中央調(diào)控階段和結(jié)構(gòu)改變階段。其中中央調(diào)控階段根據(jù)起始激活Caspase的不同,凋亡活化途徑可分為3種:內(nèi)源性途徑、外源性途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑,以上3種途徑最后匯集到同一通路,即Caspase-9,8,12均切割激活Caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。故Caspase家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件,又稱為死亡蛋白,它的切割和激活中存在級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)和正反饋。其中激活Caspase-3之前又稱為凋亡的可逆階段,之后稱為凋亡的不可逆階段。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化的方法檢測Caspase-3,以提示腦細(xì)胞的損害。

亞低溫是采用人工誘導(dǎo)的方法將體溫下降2℃～6℃,以達(dá)到治療的目的。近年大量的實(shí)驗(yàn)研究表明,亞低溫對H IBD新生動(dòng)物有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用,其作用機(jī)制主要有:降低腦組織氧耗量和無氧代謝;減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)過量釋放及其受體的激活;減少Ca2+內(nèi)流,阻斷鈣對神經(jīng)元的毒性作用;抑制氧自由基和一氧化氮大量生成減少腦水腫;抑制細(xì)胞活化;抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。因此亞低溫的作用是多途徑多靶點(diǎn)非特異的,優(yōu)于其他任何藥物性治療。且具有簡便、快捷、安全等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是新生兒H IBD臨床治療最具有潛力的措施之一。Shankaran等[8-9]開展的亞低溫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和新生兒研究總結(jié),將全身體溫降至34.5℃(此時(shí)腦組織的溫度和食道內(nèi)的溫度是一致的)對患兒及動(dòng)物是安全的,未觀察到不良事件的發(fā)生。并且得出結(jié)論亞低溫是圍生期窒息所致中重度腦病最有希望的治療措施。美國心臟協(xié)會(huì)、美國兒科協(xié)會(huì)[10]在2005年新生兒復(fù)蘇指南中對幾個(gè)多中心研究的結(jié)果進(jìn)行了綜述后指出,到目前為止還沒有報(bào)告中度低溫(即33℃～34.5℃)引起并發(fā)癥。虞人杰[11]認(rèn)為亞低溫可望成為H IBD的有效治療方案。

本研究建立了新生大鼠H IBD模型,并給予亞低溫治療,探討了其對腦組織Caspase-3的影響。研究發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)可見到少量的凋亡細(xì)胞,Caspase-3有表達(dá),但是表達(dá)很低,各時(shí)間點(diǎn)之間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Caspase-3陽性表達(dá)在H IBD模型組隨著時(shí)間延長表達(dá)逐漸增多,24 h及48 h較多,72 h腦組織Caspase-3陽性表達(dá)仍多于假手術(shù)組,這與先前的研究結(jié)果一致[12];亞低溫治療組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3陽性表達(dá)均明顯降低,與H IBD組各時(shí)間點(diǎn)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。亞低溫可以降低H IBD后Caspase-3的表達(dá),從而抑制凋亡,可以起到腦保護(hù)作用,對于治療新生兒H IBD及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷開辟了新道路,有廣闊的應(yīng)用前景。對于亞低溫療法在臨床中的開展將作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。

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