李 君,錢 濤,高維娟,唐敬龍,張鴻波

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由腦血管疾病所致的智能及認(rèn)知功能障礙臨床綜合征,它是老年期癡呆中的一種常見類型。在西方國家,VD成為繼阿爾茨海默病(A lzheimer's,AD)之后第二位導(dǎo)致癡呆的病因,而亞洲VD的發(fā)病率較高,主要與中風(fēng)高發(fā)有關(guān)[1]。隨著人口的老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變,VD的發(fā)病呈增加趨勢(shì)。因此,積極探討VD的發(fā)病機(jī)制和治療方法,具有重要意義。目前,臨床上治療VD有多種藥物,如膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑和神經(jīng)營養(yǎng)藥物等,但其療效沒有確切統(tǒng)一的結(jié)論,分析與VD發(fā)病機(jī)制的多樣性、復(fù)雜性有關(guān)。中藥成分復(fù)雜,有望在治療VD方面起到改善認(rèn)知功能的作用。VD屬中醫(yī)“呆病”范疇,辨證多屬氣虛血瘀癥,治以益氣活血為主。補(bǔ)陽還五湯作為益氣活血中藥的代表方劑,具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功效。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察補(bǔ)陽還五湯對(duì)VD模型大鼠行為學(xué)及海馬組織形態(tài)學(xué)的影響,為臨床治療VD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD雄性大鼠60只,體重20 0 g～250 g,由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心供給,合格證號(hào)為SCXK(京)2007-0001。實(shí)驗(yàn)條件下自然飲食,適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 儀器 Morris水迷宮(LW2II型,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所);連續(xù)變倍體視顯微鏡(XTS20型,北京);冰凍切片機(jī)(LEICA CM 1800,Germany);圖像分析儀(Beckman公司,USA);膠凍劑(Thermo Shandon,USA);WH-A300W高頻電刀(北京);江灣Ⅰ型C立體定向儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.3 藥物和試劑 補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍組成(北京同仁堂醫(yī)藥公司承德分公司提供,批號(hào):080103);尼莫地平片(天津華津制藥廠,國藥準(zhǔn)字H 41022175,批號(hào):080317,規(guī)格20 mg);Sodium Pentobarbitone(10 g,Germany);多聚甲醛(分析純,天津市化學(xué)試劑研究所,批號(hào)970606);磷酸氫二鈉(分析純,天津市化學(xué)試劑六廠,批號(hào)970413),磷酸二氫鈉(分析純,天津市化學(xué)試劑六廠,批號(hào)970726)。

1.2 方法

1.2.1 藥物處理 補(bǔ)陽還五湯方劑組成及比例,黃芪∶當(dāng)歸∶赤芍∶地龍∶川芎∶紅花∶桃仁(80∶4∶3∶2∶2∶2∶2),1 g藥物相當(dāng)于1 g生藥,按本室方法制備濃度為12.5 g/m L的水煎醇提液,實(shí)驗(yàn)時(shí)用雙蒸水配成濃度為6.25 g/m L的混懸液。尼莫地平用雙蒸水經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎機(jī)制成濃度為2.5 mg/m L的混懸液。高壓滅菌,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 模型制作 采用Pullinsin-4VO改良法制成VD大鼠模型。大鼠腹腔注射1%Sodium Pentobarbitone(10 mg/m L)45 mg/kg麻醉。假手術(shù)組大鼠不熱凝椎動(dòng)脈和不夾閉頸總動(dòng)脈,其他手術(shù)進(jìn)程同模型組;正常組大鼠不作任何手術(shù)處理。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥方法 將造模成功的大鼠隨機(jī)分成模型組、補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組。另設(shè)假手術(shù)組及正常對(duì)照組,每組12只。補(bǔ)陽還五湯用量為50 g/(kg?d),尼莫地平用量為20 mg/(kg?d),模型組、假手術(shù)組和正常對(duì)照組均給予蒸餾水1m l/100 g灌胃。術(shù)后第1天即用藥,每日灌胃1次,共給藥30 d。

1.2.4 Morris水迷宮試驗(yàn)

1.2.4.1 定位航行試驗(yàn) 試驗(yàn)歷時(shí)4 d。每只大鼠每天從4個(gè)不同象限入水點(diǎn)入水進(jìn)行訓(xùn)練,各1次,取平均值為每天逃避潛伏期。訓(xùn)練中,若大鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái),于平臺(tái)上站立10 s;若未找到,用棒將其引上平臺(tái),站立10 s,潛伏期限記為60 s。將大鼠從平臺(tái)上拿下來休息60 s之后,再按序由下一入水點(diǎn)入水進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 空間探索試驗(yàn) 第5天撤去平臺(tái),將大鼠從第二象限入水點(diǎn)放入水槽,記錄60 s內(nèi)其經(jīng)過平臺(tái)象限的次數(shù),即為空間探索次數(shù)。

1.2.5 海馬組織形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后30 d,常規(guī)取材、固定,用1%Sodium Pentobarbitone 45mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后仰臥固定,剪開右心耳。開顱取腦,并將腦組織置于4%多聚甲醛中浸置4 h～6 h(4℃)后,取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織,組織經(jīng)蔗糖溶液脫水。HE染色,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,光鏡下觀察海馬形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目和丟失率的檢測(cè) 以圖像分析儀分別對(duì)HE染色圖片的海馬CA1區(qū)進(jìn)行處理,測(cè)量單位面積海馬神經(jīng)元數(shù)目。采用甲苯胺藍(lán)染色計(jì)數(shù)海馬CA 1區(qū)殘余神經(jīng)元,結(jié)果以神經(jīng)元丟失率(LR)表示。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)檢測(cè) M orris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中,模型組的逃避潛伏期明顯長于正常對(duì)照組(P＜0.05),補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組明顯短于模型組(P＜0.05)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中,模型組的空間探索次數(shù)明顯少于正常對(duì)照組(P＜0.05),而補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組明顯多于模型組(P＜0.05)。和正常對(duì)照組相比,假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期、空間探索次數(shù)均無(P＞0.05)。詳見表1。

表1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

表1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

組別n逃避潛伏期s探索次數(shù)/m in正常對(duì)照組12 7.67±3.42 16.86±5.37假手術(shù)組12 8.76±4.03 14.42±4.01模型組12 29.56±13.281)4.26±0.801)補(bǔ)陽還五湯組12 16.96±7.062)8.96±1.302)尼莫地平組12 20.16±8.892)8.74±2.522)與正常組相比,1)P＜0.05;與模型組相比,2)P＜0.05

2.2 腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué) H E染色后正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則,層次豐富,細(xì)胞線清晰,細(xì)胞排列整齊密集,胞核、胞質(zhì)清晰;模型組大鼠海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂、松散,細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙,核固縮,染色質(zhì)深染,可見凝固性壞死伴明顯細(xì)胞脫失;補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)介于正常組、假手術(shù)組和模型組之間,可明顯減輕海馬內(nèi)核固縮現(xiàn)象。

2.3 腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目和丟失率 和正常對(duì)照組相比,假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)目和丟失率無明顯變化;模型組大鼠海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元脫失明顯,數(shù)目減少,神經(jīng)元丟失率升高(P＜0.05),可見膠質(zhì)細(xì)胞增生;較模型組相比,補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組均可見海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元脫失現(xiàn)象明顯減輕,數(shù)目增多,神經(jīng)元丟失率明顯降低(P＜0.05)。詳見表2。

表2 大鼠海馬CA 1區(qū)單位面積神經(jīng)元數(shù)(±s)

表2 大鼠海馬CA 1區(qū)單位面積神經(jīng)元數(shù)(±s)

組別n神經(jīng)元數(shù)/mm2神經(jīng)元丟失率%正常對(duì)照組12 97.28±10.12 0假手術(shù)組12 82.56±6.36 1.62±1.70模型組12 44.62±7.351)50.98±5.211)尼莫地平組12 65.32±5.802)16.86±4.172)補(bǔ)陽還五湯組12 74.72±6.502)15.59±3.752)與正常對(duì)照組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05

3 討 論

血管性癡呆是老年期癡呆的一種重要類型,腦缺血造成海馬損傷引起學(xué)習(xí)記憶能力下降,是發(fā)生VD的重要原因。而海馬是缺血損傷最敏感腦區(qū),直接參與信息貯存和回憶[2,3]。趙建新等[4]認(rèn)為海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡可能是缺血性腦血管病導(dǎo)致癡呆的主要原因。即使短暫的腦缺血也可造成神經(jīng)元延遲性神經(jīng)元死亡[5]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元明顯減少,喪失率明顯升高;補(bǔ)陽還五湯組神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量則非常接近假手術(shù)組和正常組,表明補(bǔ)陽還五湯可以保護(hù)缺血對(duì)CA 1區(qū)神經(jīng)元的損傷。

益氣活血中藥有顯著的抗VD作用,可明顯改善VD模型大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力[6-10]。補(bǔ)陽還五湯作為益氣活血中藥的代表方劑具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功效。君藥黃芪可補(bǔ)諸虛不足,益元?dú)?臣以當(dāng)歸,原方用歸尾,歸尾主通,逐瘀自驗(yàn);赤芍、川芎、紅花、桃仁四味為佐,協(xié)同歸尾以活血化瘀;地龍通經(jīng)活絡(luò),力專善走,配合諸藥以行藥勢(shì),用以為使。全方重用補(bǔ)氣藥配合小量活血化瘀藥,使周身元?dú)饬魍?血無凝滯。補(bǔ)陽還五湯具有抑制血小板聚集、改善血液流變學(xué)狀態(tài)、調(diào)節(jié)腦組織能量代謝和一氧化氮(NO)的生成、抑制腦組織細(xì)胞凋亡等作用,從而保護(hù)神經(jīng)元[11-12]。尼莫地平是二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑,具有改善腦循環(huán)和腦代謝的作用,臨床上可用于治療輕重度±s)VD[13]。本實(shí)驗(yàn)證明,補(bǔ)陽還五湯和尼莫地平都可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,且補(bǔ)陽還五湯組優(yōu)于尼莫地平組,補(bǔ)陽還五湯能明顯減輕缺血對(duì)海馬的損傷,保護(hù)神經(jīng)元,提高VD大鼠Morris水迷宮成績(jī),這可能是其增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制之一。但對(duì)其改善學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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