騫 健,張巧俊

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種漸進(jìn)性發(fā)展的神經(jīng)變性疾病,它不僅表現(xiàn)為嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙,而且常伴有情感障礙,認(rèn)知及記憶功能方面的障礙。海馬與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系極為密切,長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是突觸部位傳遞效能增強(qiáng)的一種現(xiàn)象,是突觸可塑性的表現(xiàn)形式,可能是學(xué)習(xí)和記憶的電生理指標(biāo),而LTP的產(chǎn)生需要突觸前后成分的共同參與,即一般依賴(lài)于邊緣系統(tǒng),LTP是行為學(xué)習(xí)的神經(jīng)元機(jī)制,以往研究多認(rèn)為海馬離子型谷氨酸受體(iG lu Rs)與LTP的誘導(dǎo)有關(guān),而海馬的代謝型谷氨酸受體(mG luRs)在學(xué)習(xí)記憶中作用不明確。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外神經(jīng)生理領(lǐng)域研究的最新進(jìn)展發(fā)現(xiàn)海馬mG luRs也參與學(xué)習(xí)、記憶的神經(jīng)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)多克隆抗體mG luR5在帕金森病模型鼠海馬各區(qū)表達(dá)變化的研究,探討海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)可能的誘導(dǎo)機(jī)制,以及與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組 SD雄性大鼠30只,體重220 g～250 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、PD模型組(B組)、非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑D-AP-5+PD組(C)組,每組10只。PD模型鼠的制備(B組):黑質(zhì)致密部注射6-OHDA;正常對(duì)照組(A組):不作任何處理;D-AP-5+PD組(C組)帕金森病模型鼠制作時(shí)黑質(zhì)致密部注射D-AP-5,4μL(40 nmo l/μL),5 m in內(nèi)注射完,停針30 min后再注射6-OHDA。

1.2 灌注與取材 將各組大鼠灌注固定。開(kāi)顱取腦,修塊后置4%多聚甲醛溶液于4℃冰箱后固定4 h,后入20%蔗糖溶液過(guò)夜至沉底。第2天將組織塊經(jīng)PBS洗滌后將含有海馬的腦組織冠狀連冰冷切片,片厚40μm,收集于PBS中。免疫細(xì)胞化學(xué)法采用SABC法(漂浮法)。

1.3 圖像分析 在明視野顯微鏡下認(rèn)定有反應(yīng)的結(jié)構(gòu)部位后,經(jīng)H PIAS-1000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像采集分析系統(tǒng)在17 186.5μm2標(biāo)準(zhǔn)框下對(duì)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行掃描。每組標(biāo)本測(cè)10個(gè)視野范圍(×200)內(nèi)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞面積/掃描面積(R)和平均光密度值(OD值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 海馬中mG luR5免疫組織學(xué)變化 A組大鼠海馬中有豐富的mG lu R5表達(dá),齒狀回和CA1區(qū)表達(dá)最為豐富,以CA 1區(qū)錐體細(xì)胞層和齒狀回顆粒細(xì)胞層表達(dá)最高,CA3區(qū)錐體細(xì)胞層次之;B組mGluR 5表達(dá)同A組相比各區(qū)均明顯下降(P＜0.01);C組mG luR5表達(dá)又有明顯上調(diào)(P＜0.05)。mG luR5的表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜上。

2.2 圖像分析 大鼠海馬mG luR5陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞面積/掃描面積(R)及平均光密度(OD)的比較。詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠海馬mG luR5免疫反應(yīng)產(chǎn)物圖像分析結(jié)果(±s)

表1 大鼠海馬mG luR5免疫反應(yīng)產(chǎn)物圖像分析結(jié)果(±s)

組別陽(yáng)性細(xì)胞面積/掃描面積(R)平均光密度(OD)A組0.10±0.03 0.52±0.15 B組0.05±0.021)0.43±0.061)C組0.07±0.041)0.50±0.061)與正常對(duì)照組相比,1)P＜0.05

3 討 論

海馬與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系極為密切,帕金森病不僅表現(xiàn)為嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙,而且常伴有情感障礙,認(rèn)知及記憶功能方面的障礙。海馬部位突觸效能的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是行為學(xué)習(xí)的神經(jīng)元機(jī)制,被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。新近深入的研究認(rèn)為mG luRs可能在LTP和LTP的誘發(fā)中起重要的調(diào)節(jié)作用。

研究證實(shí),突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是中樞興奮性突觸的傳遞效能的持久變化,和動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)[1]。在海馬的CA1區(qū),mG luR5可能通過(guò)激活蛋白激酶C(PKC)等,促使由NMDA受體激活產(chǎn)生的短時(shí)程增強(qiáng)(short-term potentiation,STP)向長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)轉(zhuǎn)變,在海馬CA3區(qū)LTP的誘導(dǎo)下需NMDA受體參加,因此,激活mG luR5無(wú)論對(duì)于海馬依賴(lài)NM DA受體的LTP,還是不依賴(lài)NMDA受體的LTP都是一個(gè)必要條件。mG luR5與G蛋白耦聯(lián),通過(guò)細(xì)胞及多種信使系統(tǒng)介導(dǎo)慢突觸傳遞,在LTP的誘導(dǎo)和維持中起重要的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)在帕金森病模型大鼠觀察到海馬各區(qū)mG luR5表達(dá)均明顯下降,推測(cè)這些區(qū)域可能對(duì)帕金森病的發(fā)生較為敏感,mG luR5表達(dá)下降,可能是神經(jīng)細(xì)胞的一種自我保護(hù)作用,至于通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)mG luR5表達(dá)下降,其作用機(jī)制目前還不清楚。G lu是公認(rèn)的神經(jīng)毒性物質(zhì),與各種腦損傷關(guān)系密切。由于NMDA受體的高度Ca2+通透性,NMDA受體在這些毒性反應(yīng)中起主要作用。然而對(duì)各種慢性改變及損傷,延遲的毒性反應(yīng)與G lu誘導(dǎo)的G lu釋放有關(guān)[2]。mGluR5對(duì)NMDA受體和谷氨酸傳遞均有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)mG luR5在帕金森病模型鼠海馬各區(qū)表達(dá)下降,應(yīng)用非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑D-AP-5后表達(dá)又上調(diào),說(shuō)明mGluR5可能在帕金森病LTP誘導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用,其作用機(jī)制可能為NMDA受體依賴(lài)性。mG luR5可能與帕金森病認(rèn)知和情感及記憶功能障礙有關(guān)。但具體作用機(jī)制,尤其是LTP誘導(dǎo)后mGluR5在LTP的維持和鞏固階段的神經(jīng)機(jī)制還不完全清楚。mG luR5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與許多生理及病理過(guò)程有關(guān),然而,由于缺乏高特異性的mG lu Rs激動(dòng)劑和拮抗劑,對(duì)它在正常和異常狀態(tài)下許多作用及與其他神經(jīng)遞質(zhì)或受體的進(jìn)一步關(guān)系還不清楚。隨著科學(xué)的發(fā)展,mGluRs的高特異性激動(dòng)劑或拮抗劑將被發(fā)現(xiàn),同時(shí),反意cDAN、反意m RNA方法和基因敲除技術(shù)也將被用于mG luRs研究,這將更深入了解mGluR5及臨床應(yīng)用,使醫(yī)學(xué)能阻止神經(jīng)元的變性、壞死,改善學(xué)習(xí)記憶成為可能。

[1] 段虎斌,劉躍亭,郝春艷,等.蒼白球腹后部毀損術(shù)治療帕金森病的長(zhǎng)期療效分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2006,4(6):482-484.

[2] Monyer H,Giffard RG,Hartley DM,eta l.Oxygen or glucose deprivation-induced neu ronal in jury in cortical cell cultures is reduced by tetanus toxin[J].Neuron,2008,8:967-973.