冉小琪，袁 若，柴雅琴，洪成林，劉凱歌

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶市分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

0 引言

甲胎蛋白（α-1-fetoprotein，AFP）是由美國(guó)科學(xué)家Bergstrand和Czar于1956年在肝癌患者的血清中檢測(cè)出的一種球蛋白[1]。AFP是胎兒早期由肝臟和卵黃囊產(chǎn)生的一種胚胎性蛋白，成人體內(nèi)由肝細(xì)胞產(chǎn)生，正常成人體內(nèi)含量極微。在大多數(shù)原發(fā)性肝癌或胚胎性癌患者體內(nèi)，AFP的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，因此血清中AFP含量的檢測(cè)對(duì)此類病癥的診斷具有重要的意義[2～4]。目前基于抗體-抗原識(shí)別檢測(cè)AFP的方法有很多種，應(yīng)用較多的主要有酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）、放射免疫測(cè)定法（RIA）、間接血凝法、瓊脂雙擴(kuò)散法等[5～6]。這些方法具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要對(duì)抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記，費(fèi)用高，有放射性等缺點(diǎn)。電化學(xué)免疫傳感器由于其靈敏度高、費(fèi)用低、體積小、半自動(dòng)化和便于攜帶等特點(diǎn)，而具有重要的理論研究意義和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

該文將anti-AFP固定在由納米金/鐵氰化鎳納米顆粒（NiHCFNPs）/納米金修飾的玻碳電極表面，納米金具有擴(kuò)大電極比表面積和增大抗體固定量的功能，同時(shí)能提供和自然相似的微環(huán)境并保持固定分子的生物活性，使得修飾電極表面能吸附大量抗體并很好地保持其生物活性[7]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在普魯士藍(lán) （PB）類化合物中，NiHCFNPs展示了特殊的氧化還原特性，是一種良好的電活性物質(zhì)，在設(shè)計(jì)傳感器時(shí)將其加入，可以改善傳感器的性能（靈敏度，檢測(cè)限等）[8]。由于-NH2，-SH，-CN和納米金之間存在強(qiáng)烈的化學(xué)作用[9～10]，NiHCFNPs和納米金之間具有高的親和性，因而可以直接將NiHCFNPs固定在沉積了納米金的電極表面。NiHCFNPs具有大的比表面積，可以為固定第二層納米金提供很好的生物兼容界面，再利用納米金和-NH2間的化學(xué)吸附作用去固定anti-AFP。此外用這種方法形成的納米金能提供一個(gè)穩(wěn)定、粗糙和緊湊的表面，使之固定的抗體量增加。實(shí)驗(yàn)證明根據(jù)此原理制備的電極可以有效的測(cè)定AFP，并且檢測(cè)限低，靈敏度高，線性范圍寬，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器廠），pHS-3C型酸度計(jì) （上海大普儀器有限公司），透射電鏡（TECNAI 10，飛利浦，荷蘭），CS501-SP 型超級(jí)數(shù)顯恒溫器 (重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)，KQ218超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），AB203-S電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

甲胎蛋白抗體和抗原（鄭州賽博生物工程有限責(zé)任公司）；牛血清白蛋白(96%～99%)、氯金酸（HAuCl4）、 檸檬酸鈉（Sigma 公司），K3Fe(CN)6和NiCl2·6H2O（四川化學(xué)試劑公司），其它試劑為分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）由Na2HPO4-KH2PO4配制，并由0.1 mol/L KCl做支持電解質(zhì)。

1.2 鐵氰化鎳納米顆粒(NiHCFNPs)的制備[11]

把 70mL 0.01 mol/L NiCl2溶液逐滴加到劇烈攪拌的含有 0.05 mol/L KCl的 70mL 0.05 mol/L K3Fe(CN)6溶液中。在NiCl2溶液滴加完后，混合溶液繼續(xù)劇烈攪拌5 min。再將混合液立即高速離心并洗滌數(shù)次后轉(zhuǎn)到真空干燥箱中，室溫下過(guò)夜，最終得到黃色粉末NiHCFNPs。

1.3 免疫傳感器的制備

首先，將玻碳電極（φ=4 mm）分別用 1.0、0.3 μm Al2O3粉拋光成鏡面，每次拋光后都用二次去離子水沖洗干凈。拋光后的電極依次用二次去離子水、1∶1硝酸、乙醇和二次去離子水超聲清洗干凈。

清洗后的玻碳電極立即浸入2 mg/mL的HAuCl4溶液中，并在恒定電位-0.2 V下沉積60 s。 用蒸餾水沖洗后，電極表面滴加 10 μL 0.05 mg/mL超聲5 min后的NiHCFNPs混懸液，將電極轉(zhuǎn)移到4℃下冰箱中放置3 h，取出用二次蒸餾水沖洗后，將電極再次浸入到2 mg/mL HAuCl4水溶液中恒定電位-0.2 V下沉積30 s并用二次蒸餾水沖洗干凈。

將洗凈的納米金/NiHCFNPs納米金修飾電極浸到anti-AFP中4℃12 h，最后將電極在室溫下浸入2.5%的BSA溶液中1 h封閉非特異性吸附點(diǎn)位。修飾好的電極不用時(shí)懸置于PBS溶液上方4℃下儲(chǔ)存。免疫傳感器的逐步修飾過(guò)程如圖1所示。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)測(cè)量以免疫電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極作為參比電極。所用的循環(huán)伏安法（CV），是一種有效、便捷的用來(lái)探測(cè)修飾電極表面特征的方法。在室溫下的0.02 mol/L PBS(pH=7.0)里，在 0.0～0.8 V（對(duì)飽和甘汞電極）電位區(qū)間，掃速為50 mV/s條件下進(jìn)行CV測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 NiHCFNPs的形態(tài)

NiHCFNPs的大小及形狀直接影響著電極的性能，采用透射電鏡TEM對(duì)其進(jìn)行表征。圖2展示了NiHCFNPs相對(duì)均一的微結(jié)構(gòu)，平均尺寸為20 nm。

2.2 免疫傳感器的電化學(xué)特征

圖3為電極組裝過(guò)程的循環(huán)伏安表征圖。裸的玻碳電極由于缺少電活性物質(zhì)，沒(méi)有出現(xiàn)氧化還原峰（圖3曲線a）；當(dāng)在裸的玻碳電極上沉積一層納米金后，由于納米金可以促進(jìn)電子傳輸，背景電流有所增加（圖3曲線b）；在納米金修飾的玻碳電極上自組裝一層電活性物質(zhì)NiHCFNPs后，出現(xiàn)一對(duì)明顯的氧化還原峰，且峰電流非常大（圖3曲線c）；在 NiHCFNPs/納米金/GCE上再次沉積一層納米金后，峰電流再次大幅增加（圖3曲線d），原因是NiHCFNPs層結(jié)合的納米金促進(jìn)電子傳遞；將納米金/NiHCFNPs/納米金/GCE在anti-AFP中浸泡12 h后，峰電流明顯下降（圖3曲線e），證明anti-AFP已經(jīng)結(jié)合到了電極上，生成的蛋白質(zhì)大分子嚴(yán)重阻礙了電子傳輸?shù)诫姌O表面；用BSA封閉后，由于BSA阻礙電子傳輸，峰電流進(jìn)一步下降（圖3曲線f）。

圖1 免疫傳感器的組裝過(guò)程Fig.1 Preparation process of the immunosensor

圖2 NiHCFNPs的TEM表征圖Fig.2 TEM image of NiHCFNPs

圖3 電極制備過(guò)程中的循環(huán)伏安表征圖(a)裸的玻碳電極;(b)在玻碳電極表面電沉積納米金;(c)自組裝NiHCFNPs層;(d)再沉積納米金;(e)固定一層抗體膜;(f)用BSA封閉Fig.3 The diagram of the CVs of the stepwise

將免疫電極在0.02 mol/L PBS（pH=7.0）中用不同掃速進(jìn)行循環(huán)伏安表征，隨著掃描速度的不斷增加，峰電流值也逐漸增大，且峰電流值與掃描速率的平方根（v1/2）成正比，說(shuō)明該免疫電極受擴(kuò)散控制。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 第一層納米金沉積時(shí)間的優(yōu)化

電化學(xué)還原氯金酸的時(shí)間與所形成的納米金層的厚度、量有著直接的關(guān)系，影響著NiHCFNPs的固定并將進(jìn)一步影響傳感器的性能。還原時(shí)間越長(zhǎng)，納米金的量越多，但是如果還原時(shí)間超過(guò)一定值時(shí)，將可能導(dǎo)致納米金層過(guò)厚，阻礙電子的傳輸并影響傳感器的響應(yīng)。在Fe(CN)64-/3-溶液（pH=7.0）中對(duì)第一層納米金的還原時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。如圖4所示，在60 s時(shí)，電流響應(yīng)達(dá)到最大值。因此第一層納米金的還原時(shí)間選作60 s。

圖4 第一層納米金在玻碳電極表面還原時(shí)間的影響Fig.4 The effect of electrochemical reduction time of the frist layer of nano-Au

2.3.2 第二層納米金時(shí)間的優(yōu)化

同樣，第二層納米金的還原時(shí)間也需要優(yōu)化。在0.02 mol/L PBS（pH=7.0）中測(cè)定第二層納米金還原時(shí)間對(duì)電流響應(yīng)的影響。根據(jù)圖5知，在還原時(shí)間為30 s的時(shí)候，峰電流最大，因此實(shí)驗(yàn)中采用30 s。

2.3.3 孵育時(shí)間的優(yōu)化

抗體與抗原形成免疫復(fù)合物的反應(yīng)平衡與孵育時(shí)間有著直接的關(guān)系。圖6展示了當(dāng)使用20.0 ng/mL AFP做孵育底液時(shí)孵育時(shí)間對(duì)傳感器響應(yīng)的影響。由圖可知，傳感器的響應(yīng)電流隨著孵育時(shí)間的增加而增加，到25 min之后，增加孵育時(shí)間，電流響應(yīng)慢慢持平，表明免疫反應(yīng)達(dá)到了平衡。故實(shí)驗(yàn)中選擇孵育時(shí)間為25 min。

圖5 第二層納米金在玻碳電極表面還原時(shí)間的影響Fig.5 The effect of electrochemical reduction time of the second layer of nano-Au

2.3.4 工作底液酸度的優(yōu)化

檢測(cè)了pH從5.0到9.0范圍內(nèi)的0.02 mol/L PBS中該免疫傳感器的電流響應(yīng)變化情況（圖7）。當(dāng)pH值從5.0增加到7.0時(shí),峰電流逐漸增加，pH從7.0到9.0增加時(shí)峰電流下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示在pH為7.0時(shí)，響應(yīng)電流最大。因此實(shí)驗(yàn)中選擇pH為7.0的磷酸緩沖液作為測(cè)試底液。

圖6 孵育時(shí)間對(duì)免疫反應(yīng)的影響Fig.6 The effect of incubation time on immunoreaction

2.4 免疫傳感器的性能

在選定條件下，傳感器在不同濃度的AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，圖8展示了CV峰電流信號(hào)對(duì)AFP濃度的校準(zhǔn)曲線，由圖8可知峰電流與AFP濃度在1.0～10.0 ng/mL 和 10.0～200.0 ng/mL 兩個(gè)濃度范圍內(nèi)成線性，兩段線性的斜率分別為-5.878和 -0.215 1 μA/(ng/mL)， 相關(guān)系數(shù)分別為0.992 4和 0.992 1， 檢出限為 0.2 ng/mL（S/N=3 時(shí)）。

圖7 工作底液酸度對(duì)電極的影響Fig.7 The influence of pH of the PBS on the response of the immunosensor

圖8 免疫傳感器檢測(cè)AFP的線性圖Fig.8 Calibration plot of the immunosensor for detection of AFP

2.5 免疫傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性

當(dāng)傳感器在PBS緩沖液中分別重復(fù)連續(xù)測(cè)定11次時(shí)，產(chǎn)生了3.3%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)中還研究了連續(xù)穩(wěn)定性，當(dāng)免疫傳感器在PBS緩沖液中連續(xù)掃描50圈，產(chǎn)生了3.7%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.6 免疫傳感器的選擇性

將免疫傳感器孵育在包含20.0 ng/mL AFP以及其它可能和AFP共存的物質(zhì)中測(cè)定免疫傳感器的選擇性。該文研究了濃度分別為20.0 ng/mL的癌胚抗原，牛血清白蛋白，蛋氨酸，異亮氨酸，甘氨酸，L-半胱氨酸對(duì)AFP測(cè)定的干擾。其干擾可以用傳感器在20.0 ng/mL AFP中含有干擾物質(zhì)和不含干擾物質(zhì)中孵育的電流響應(yīng)值之比來(lái)評(píng)定。表1即為以上物質(zhì)對(duì)AFP的干擾測(cè)定結(jié)果，實(shí)驗(yàn)表明，不存在明顯干擾。

表1 免疫傳感器的選擇性Tab.1 Possible interferences tested with the immunosencor

3 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)利用納米金和NiHCFNPs納米顆粒固定anti-AFP，從而構(gòu)建了一種新型的高靈敏度的電流型AFP免疫傳感器。所研究的免疫傳感器具有靈敏度高，制作簡(jiǎn)單，檢測(cè)下限低，成本低，穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，有望用于AFP的醫(yī)學(xué)研究和臨床檢驗(yàn)。

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