浦津,何耀華,劉衛(wèi)華

(1.上海市閘北區(qū)市北醫(yī)院骨科,上海 200443;2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科,上海 200233)

20世紀(jì) 90年代初 ,研究發(fā)現(xiàn)富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)中含有大量的生長(zhǎng)因子,對(duì)骨的自然修復(fù)有良好的促進(jìn)作用。其中以血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)最為重要。近年來(lái)的研究表明 ,PRP有較強(qiáng)的成骨能力[1,2]。骨科界已將其引入骨重建領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)研究以兔橈骨缺損為模型,用 PRP與羥基磷灰石生物陶瓷復(fù)合進(jìn)行骨缺損的修復(fù) ,取得良好效果,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔 12只(由新華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重 2.5～ 3.1 kg,雌雄不限。采用自身對(duì)照方法,所有動(dòng)物均在其雙前肢橈骨中下段連同骨膜制成長(zhǎng) 1cm的骨缺損,選擇左側(cè)前肢為實(shí)驗(yàn)側(cè),右側(cè)前肢為對(duì)照側(cè)。實(shí)驗(yàn)側(cè)缺損區(qū)植入 PRP和羥基磷灰石生物陶瓷(由北京華意健科貿(mào)有限公司生產(chǎn)),對(duì)照側(cè)缺損區(qū)單純植入羥基磷灰石生物陶瓷。

1.2 PRP的制作 動(dòng)物麻醉后,用 10 mL注射器抽取 1 mL復(fù)方枸櫞酸鈉抗疑劑,再?gòu)耐枚醒雱?dòng)脈抽取 5 mL血液,搖勻,置入離心管中 ,離心(3650r/min)10min。液體分成上清液層和紅細(xì)胞層,吸取上清液及交界面以下 1～2 mm的紅細(xì)胞至另一離心管,再次離心(3000 r/min)10 min。棄去上清液上 3/4,剩余液體約 0.8mL,搖勻 ,即為 PRP。取 1個(gè)2mL注射器,依次吸入 0.8mL的 PRP,0.2mL凝血?jiǎng)?(由1 mL10%的氯化鈣與 1000 U凝血酶混合組合而成)和 0.2 mL空氣(吸入空氣便于搖勻),搖勻,放置 10 s左右 ,制成PRP凝膠。整個(gè) PRP的制作過(guò)程均需無(wú)菌操作。

1.3 手術(shù)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前 12 h禁食、禁水,局部脫毛,用 2%的硫噴妥鈉(30 mg/kg)兔耳靜脈麻醉后,取俯臥位。于雙前肢橈側(cè)中下段作 2 cm長(zhǎng)皮膚切口,銳性分離顯露橈骨中下段,于中下段截骨 1cm(含骨膜),造成節(jié)段性橈骨骨缺損模型,生理鹽水沖洗傷口,壓迫止血,按計(jì)劃在左側(cè)缺損區(qū)植入 PRP和羥基磷灰石生物陶瓷,右側(cè)缺損區(qū)植入羥基磷灰石生物陶瓷,全層縫合皮膚切口。均不行內(nèi)、外固定。

1.4 術(shù)后處理 術(shù)后常規(guī)飲食,完全負(fù)重并允許自由活動(dòng),術(shù)后 3 d青霉素(40萬(wàn) U/d)肌肉注射治療。術(shù)后 2、4、8和 12周分別處死 3只兔子進(jìn)行觀察。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血小板計(jì)數(shù) 在 12只新西蘭大白兔取血制作 PRP過(guò)程中,用血紅蛋白吸管分別從裝有全血及 PRP的離心管中吸取樣本 10μL,血小板稀釋液稀釋后,高倍光鏡下人工計(jì)數(shù)。

1.5.2 生長(zhǎng)因子濃度測(cè)定 采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法進(jìn)行 TGF-β和 PDGF的濃度測(cè)定。

1.5.3 大體形態(tài)觀察 術(shù)后 2、4、8和 12周各時(shí)間點(diǎn)取骨缺損修復(fù)標(biāo)本作大體觀察,觀察骨缺損修復(fù)程度,缺損交界面骨連接情況。

1.5.4 組織學(xué)觀察 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)取缺損區(qū)及兩端各 0.4 cm正常骨組織,標(biāo)本置于 10%中性甲醛中固定,脫鈣,石蠟包埋,以缺損區(qū)為中心縱行切片,HE染色后,光鏡下觀察兩端及中央部位新骨生成情況。同時(shí)應(yīng)用 MDGS圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析,統(tǒng)計(jì)新骨在缺損區(qū)所占的面積百分比。

1.5.5 射透電鏡 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn),所取標(biāo)本經(jīng) 2.5%戊二醛固定液固定,4.13%乙二胺四乙酸二鉀脫鈣,1%鋨酸固定,0.5%醋酸鈾染色,脫水包埋。觀察新生骨細(xì)胞成熟度。

1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用 SPSS11.0軟件處理,樣本用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)之間的差異用樣本均數(shù) t檢驗(yàn),以 P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

所有動(dòng)物術(shù)后無(wú)感染和死亡,植入物無(wú)脫落,全部進(jìn)入結(jié)果分析。傷口 2周愈合,無(wú)感染。兔全血中的血小板濃度為2.8× 105/mm3,PRP中血小板濃度為 9.325×105/mm3,PRP中血小板濃度為全血的 3.18倍。

2.1 生長(zhǎng)因子濃度 兔全血的 TGF-β為(36.4±5.1)ng/mL,PDGF為 (149.5± 30.1)ng/mL;PRP中 TGF-β為(23.4± 5.8)ng/mL,PDGF為 (95.9± 12.5)ng/mL。

2.2 大體形態(tài)觀察 術(shù)后第 2周,實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)人工骨與自體骨交界處及人工骨表面均以肉芽組織包裹連接,無(wú)明顯差異 ,實(shí)驗(yàn)側(cè)肉芽組織量略多,且血供較為豐富。第 4周,實(shí)驗(yàn)側(cè)在人工骨表面有較多骨痂生成,人工骨與自體骨交界面不清晰;對(duì)照側(cè)兩端僅有少量骨樣組織,人工骨表面有較多結(jié)締組織,而骨樣組織較少。第 8周,實(shí)驗(yàn)側(cè)人工骨表面大部分被骨組織覆蓋,人工骨表面的腔隙已被充填;對(duì)照側(cè)骨組織少,骨痂限于人工骨兩端,表面的腔隙可見(jiàn)。第 12周,兩側(cè)骨組織形成量均增加,實(shí)驗(yàn)側(cè)人工骨已被骨痂完全包裹;對(duì)照側(cè)人工骨中段仍有部分未被骨組織覆蓋。

2.3 X線片觀察 術(shù)后第 2周,兩側(cè)的人工骨與自體骨交界處斷端整齊,間隙清晰,實(shí)驗(yàn)側(cè)斷端及缺損處骨密度略高于對(duì)照側(cè)。第 4周,實(shí)驗(yàn)側(cè)骨缺損兩端可見(jiàn)均勻的高密度影,人工骨周圍骨痂已形成,骨折線模糊;對(duì)照側(cè)斷端處密度欠均勻,人工骨周圍未見(jiàn)明顯骨痂。第 8周 ,實(shí)驗(yàn)側(cè)可見(jiàn)大量骨痂包繞人工骨表面,骨折線已消失;對(duì)照側(cè)斷端骨痂較前增多,靠近尺側(cè)的骨痂相對(duì)較為明顯,骨缺損處密度欠均勻。第12周時(shí),兩側(cè)自體骨與人工骨交界處可見(jiàn)明顯骨性連接,實(shí)驗(yàn)側(cè)人工骨外周同時(shí)見(jiàn)有皮質(zhì)骨包繞,密度與正常骨相似,對(duì)照側(cè)人工骨表面仍有較多骨痂 (見(jiàn)圖 1)。

2.4 組織學(xué)觀察 第 2周,實(shí)驗(yàn)側(cè)人工骨內(nèi)纖維結(jié)締組織增生,纖維及軟骨性骨痂形成,可見(jiàn)纖維直接成骨及軟骨內(nèi)骨化的方式形成網(wǎng)狀新生骨小梁,小梁邊緣覆以豐富的成骨細(xì)胞,骨基質(zhì)內(nèi)成骨細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞,小梁間纖維組織內(nèi)富于毛細(xì)血管;對(duì)照側(cè)纖維組織、毛細(xì)血管明顯少于實(shí)驗(yàn)側(cè) ,未見(jiàn)新生骨島、骨小梁。第 4周,實(shí)驗(yàn)側(cè)纖維性軟骨性骨痂逐漸向骨性骨痂過(guò)渡,新生的骨小梁逐漸變得粗大,邊緣成骨細(xì)胞數(shù)量減少,不同成熟度的骨小梁排列成網(wǎng)架狀編織骨,斷端大量骨小梁通過(guò);對(duì)照側(cè)人工骨空隙內(nèi)骨組織稀疏,主要為纖維組織,斷端可見(jiàn)成骨。第 8周,實(shí)驗(yàn)側(cè)斷端已被骨組織橋接,并逐漸形成板狀骨,人工骨空隙內(nèi)可見(jiàn)大量新生骨組織生成替代,在應(yīng)力的作用下出現(xiàn)骨的重建現(xiàn)象,原始哈佛氏管形成,外周見(jiàn)大量骨痂形成,并連成片狀;對(duì)照側(cè)新生骨主要集中在截骨端,骨小梁紊亂、不規(guī)則,成熟度較差,人工骨空隙內(nèi)新生骨組織爬行距離較短。第 12周,實(shí)驗(yàn)側(cè)人工骨完全修復(fù),新生骨組織替代人工骨表面被皮質(zhì)骨完全覆蓋,缺損中心區(qū)大量人工骨孔隙內(nèi)見(jiàn)較成熟骨組織;對(duì)照側(cè)僅在截骨端見(jiàn)板層骨,缺損中心區(qū)大多數(shù)人工骨孔隙內(nèi)無(wú)新生骨組織或骨組織成熟度較差 (見(jiàn)圖 2)。

圖1 術(shù)后 12周 X線片雙側(cè)骨缺損修復(fù)情況

圖2 術(shù)后 12周組織學(xué)觀察

2.5 射透電鏡觀察 術(shù)后第 2周,兩側(cè)破骨細(xì)胞較多,細(xì)胞內(nèi)溶酶體較豐富,成骨細(xì)胞均較少,細(xì)胞表現(xiàn)較為幼稚,細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞體器較少,且不活躍,細(xì)胞周圍膠原纖維均較少;但實(shí)驗(yàn)側(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多,細(xì)胞周圍膠原纖維也較對(duì)照側(cè)多,且排列整齊。第 4周 ,兩側(cè)的破骨細(xì)胞明顯減少,成骨細(xì)胞和細(xì)胞周圍膠原纖維明顯增多;實(shí)驗(yàn)側(cè)成骨細(xì)胞數(shù)量多,表現(xiàn)較成熟,細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞體器較豐富,細(xì)胞周圍膠原纖維較豐富,排列較為整齊;對(duì)照側(cè)成骨細(xì)胞少,細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞體器相對(duì)少,膠原纖維少且排列紊亂。第 8周,兩側(cè)以成骨細(xì)胞為主,部分成骨細(xì)胞已向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,可見(jiàn)板層骨雛形形成,未見(jiàn)破骨細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)側(cè)成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化較多,板層骨雛形較多,偶見(jiàn)局部鈣鹽沉積現(xiàn)象。對(duì)照側(cè)細(xì)胞周圍膠原纖維較豐富 ,排列紊亂。第 12周,實(shí)驗(yàn)側(cè)以骨細(xì)胞為主,可見(jiàn)大量板層骨,骨陷窩形成,對(duì)照側(cè)以成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化型為主,板層骨已形成,但數(shù)量較少。

2.6 計(jì)算機(jī)圖像分析 用 SPSS11.0軟件處理后 ,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,光鏡下觀察兩端及中央部位修復(fù)性新骨生成情況。同時(shí)應(yīng)用 MDGS圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析,統(tǒng)計(jì)新骨在缺損區(qū)所占的面積百分比。實(shí)驗(yàn)側(cè)修復(fù)新生骨占骨缺損面積百分?jǐn)?shù)隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,并顯著高于同一時(shí)期對(duì)照組的所有數(shù)據(jù)(見(jiàn)表 1)。

表1 兩側(cè)術(shù)后各周新生骨所占面積(%,)

表1 兩側(cè)術(shù)后各周新生骨所占面積(%,)

組 別 第 2周 第 4周 第 8周 第12周實(shí)驗(yàn)組 19.58± 7.651) 50.15± 12.692) 84.44± 9.772) 96.50± 7.052)對(duì)照組 10.98± 5.35 19.66± 10.15 42.94± 12.92 54.97± 7.65注:與同一期對(duì)照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.001。

3 討 論

骨缺損的修復(fù)一直是骨科研究領(lǐng)域的難題,1998年Marx首次將 PRP復(fù)合自體骨移植修復(fù)下頜骨缺損,顯示了良好的成骨效應(yīng)。此后有大量應(yīng)用不同載體復(fù)合 PRP修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)報(bào)道,從影像學(xué)、組織學(xué)與組織形態(tài)學(xué)上也證實(shí)了 PRP能明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[3,5,6]。也有部分實(shí)驗(yàn)報(bào)道認(rèn)為 ,只有當(dāng) PRP與自體骨混合植入,才能表現(xiàn)出對(duì)骨缺損修復(fù)的促進(jìn)作用,而單純和異體骨或人工骨混合使用,未能表現(xiàn)出對(duì)于骨缺損修復(fù)的促進(jìn)作用。Choi[7]的實(shí)驗(yàn)表明,PRP并不能促進(jìn)自體骨移植后頜骨缺損的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)的目的是為了探討 PRP與人工骨復(fù)合,在同一個(gè)體上是否具有促進(jìn)骨缺損修復(fù)作用。

從自體全血中提取的 PRP,制作簡(jiǎn)單 ,無(wú)免疫原性 ,且含有多種有利于骨愈合的生長(zhǎng)因子如 TGF-β、PDGF和類胰島素生長(zhǎng)因子等。骨形成過(guò)程中,既與單一骨生長(zhǎng)因子的分泌和表達(dá)水平有關(guān),同時(shí)又受到因子間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié),PRP中各種生長(zhǎng)因子間濃度比例最接近正常比例,提供的就是一種與體內(nèi)生長(zhǎng)因子修復(fù)系統(tǒng)相似而濃度更高的生長(zhǎng)因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。各種生長(zhǎng)因子間能發(fā)揮最佳協(xié)調(diào)作用,從而促進(jìn)移植骨的生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外研究者也證實(shí)添加多種生長(zhǎng)因子比用單一生長(zhǎng)因子更有利于促進(jìn)骨愈合。

PRP促進(jìn)骨愈合是由于其內(nèi)所含的血小板能釋放多種高濃度生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)因子是一系列有絲分裂原因子的傳遞工具,可增強(qiáng)未分化間充質(zhì)細(xì)胞增殖和血管形成,對(duì)移植物的血管化起著重要作用,在骨修復(fù)的早期尤為關(guān)鍵。在骨折的自然愈合過(guò)程中,骨折端血凝塊中的纖維蛋白和血小板聚集并釋放各種生長(zhǎng)因子,對(duì)骨折的愈合起主導(dǎo)作用。但有研究發(fā)現(xiàn),血小板在傷口內(nèi)的壽命和生長(zhǎng)因子直接效應(yīng)不超過(guò)5 d。 Marx等[8]認(rèn)為一次性植入的血小板凋亡以后,巨噬細(xì)胞將替代血小板,成為生長(zhǎng)因子的主要來(lái)源。但在本實(shí)驗(yàn)中,術(shù)后第 2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組并未有大量的巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)。

有研究表明 PRP與固體材料β-磷酸三鈣 (β-tricalcium phosphate,β-TCP)、同種異體骨、自體骨等復(fù)合后,在骨再生的各個(gè)不同階段,通過(guò)直接或間接的作用,促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化[9～11],從而促進(jìn)新骨再生。由于 PRP自身沒(méi)有強(qiáng)度,而且還需要凝血酶、鈣離子激活才能發(fā)揮生物效應(yīng),限制了它的應(yīng)用[12]。本實(shí)驗(yàn)利用 PRP中含有多種生長(zhǎng)因子的特性,與羥基磷灰石生物陶瓷結(jié)合后 ,提供抗壓強(qiáng)度、骨傳導(dǎo)性,用于修復(fù)兔橈骨骨缺損。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,從大體標(biāo)本、組織學(xué),X線片及射透電鏡觀察,術(shù)后早期 2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組并無(wú)明顯差異。隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)側(cè)新骨生長(zhǎng)速度和數(shù)量明顯優(yōu)于對(duì)照側(cè),顯示了 PRP良好的促成骨效應(yīng)。

由于本實(shí)驗(yàn)樣本量較少,且僅對(duì) PRP對(duì)成骨的影響進(jìn)行研究,對(duì) PRP與不同材料結(jié)合后成骨的生物力學(xué)方面影響尚待進(jìn)一步研究。

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