安鈺,沈應(yīng)柏,張志翔

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所,銀川750002;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083）

當(dāng)植物受到機械損傷、昆蟲取食等非生物和生物脅迫時,會產(chǎn)生一系列防御反應(yīng),這些防御反應(yīng)一方面有助于受損部位愈合,另一方面誘導(dǎo)全身反應(yīng)進一步阻止傷害的發(fā)生[1-2]。近年來關(guān)于傷害誘導(dǎo)植物體內(nèi)生理生化變化方面的研究報道有很多,在傷害脅迫研究領(lǐng)域人們?nèi)找骊P(guān)注活性氧(ROS)的產(chǎn)生和細胞抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)系[3-5]。正常情況下,植物依賴其體內(nèi)存在的 ROS清除系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸等維持自由基生成與消除的動態(tài)平衡。但另一方面,ROS積累可導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化和膜透性喪失,從而引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化變化、代謝紊亂,使植物受到傷害。同時,研究發(fā)現(xiàn)不同損傷形式誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生的防御反應(yīng)也存在差異。Maffei等[6]研究表明,經(jīng)棉貪夜蛾(Spodoptera littoralis)取食和機械損傷的利馬豆(Phaseolus lunatus)葉片中,鈣離子和活性氧的積累,及抗氧化酶活性和基因表達都表現(xiàn)出明顯差異。但也有研究表明,連續(xù)的機械損傷能夠誘導(dǎo)利馬豆釋放出與棉貪夜蛾取食非常相似的揮發(fā)物,機械損傷完全能夠模擬昆蟲取食[7]。因此,機械損傷和昆蟲取食能否誘導(dǎo)相同的防御反應(yīng),機械損傷能否完全替代昆蟲取食,還存在爭議。

合作楊(Populussimonii×P.pyramidaliscv.‘Opera 8277')是雜交品種,具有扦插育苗易生根、易繁殖、造林成活率高、適應(yīng)性強、生長快等特點,是我國北方地區(qū)特別是黃土高原以及“三北”地區(qū)主要的造林樹種,但其極易受到病蟲危害,給林業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展造成重大損失。因此,本試驗以合作楊為材料,研究了昆蟲取食和機械損傷對合作楊葉片膜質(zhì)過氧化及抗氧化酶活性的影響,并對抗氧化酶在合作楊抗病蟲防御反應(yīng)中的作用進行了探討,以期為建立新的無公害病蟲害防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以1年生合作楊(Populus simonii×P.pyramindaliscv.‘Opera 8277')扦插苗為試驗材料。3月份將插條扦插于直徑25 cm、盛有果園土的塑料盆中,定期澆水,緩苗后定期供給Hoagland營養(yǎng)液,以避免產(chǎn)生干旱脅迫或缺乏營養(yǎng)影響實驗結(jié)果。試驗于7月份進行,選取長勢較好且一致的幼苗。

實驗用蟲為楊扇舟蛾(Clostera anachoretaFabricius)3齡幼蟲,由通州區(qū)小耕垡林場提供,飼養(yǎng)于溫室的指形管中。

1.2 處理方法

機械損傷:用打孔器模擬昆蟲取食葉片的方式對合作楊的功能葉片進行損傷,損傷大約30%的葉面積;

昆蟲取食:實驗前一天晚上終止楊扇舟蛾進食,使其處于饑餓狀態(tài),第二天取8～10條健康的楊扇舟蛾幼蟲放到合作楊葉片上取食30 min后開始計時;

在各種處理0.5,1,2,4,8 h后分別取傷害葉片和鄰近的上、下位健康葉片,立即投入液氮中冷凍,-80℃保存?zhèn)溆?。以相同條件下未損傷的合作楊植株上相同部位葉片為對照,每種處理均設(shè)3個重復(fù)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 過氧化氫(H2O2)含量測定 參照劉俊等[8]的方法,用丙酮提取葉片中的 H2O2,萃取脫色,Ti(IV)-PAR比色法。按照同樣程序制備H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 H2O2的含量,結(jié)果以nmol/g FW表示。

1.3.2 丙二醛(MDA)含量測定 參照趙世杰等[9]的硫代巴比妥酸(TBA)法,最后采用公式MDA(μ mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450來計算MDA含量,結(jié)果以nmol/g FW表示。

1.3.3 酶活性測定 取0.2 g合作楊葉片,液氮研磨,加入1.5 ml預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0),勻漿在4℃下10 000 g離心20 min,上清液立即用于酶活性測定。

SOD用氮藍四唑(NBT)光化還原法[10],以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位,以U/gFW表示。CAT采用分光光度法測定[11],以每分鐘吸光值的變化來表示酶活性大小,單位為Δ OD240/min?g FW。POD 采用愈創(chuàng)木酚法測定[11],以每克鮮重每分鐘吸光值的變化值來表示酶活性大小,單位為△OD470/min?g FW。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理,實驗結(jié)果利用SAS軟件進行Duncan分析,圖中不同的字母表示各處理間的差異顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 傷害脅迫對合作楊葉片MDA含量的影響

機械損傷和昆蟲取食處理后MDA含量隨時間的增加均有一個上升過程(圖1),機械損傷處理后MDA含量略高于其相應(yīng)時間的對照,但無顯著差異。昆蟲取食2 h后,MDA含量達到最大值,較對照增加了93.9%,隨后下降,到處理后8 h,基本恢復(fù)至對照水平。機械損傷處理后MDA含量變化趨勢與昆蟲取食一致,但含量顯著低于昆蟲取食。

圖1 傷害脅迫對合作楊葉片MDA含量的影響

2.2 傷害脅迫對合作楊葉片H2O2含量的影響

機械損傷和昆蟲取食均能誘導(dǎo)合作楊處理葉片中H2O2含量的增加,且處理間存在顯著差異(圖2)。昆蟲取食葉片后,H2O2含量與對照相比均有顯著的增加(P＜0.05),且表現(xiàn)出同步性的特點。隨著昆蟲取食時間延長,H2O2含量有一個升高又恢復(fù)的過程,在取食1 h后迅速升高,并在2 h時達到最大值,較對照增加了70.5%,隨后迅速下降。機械損傷處理后,H2O2含量在早期(0.5 h)升高幅度最大,之后持續(xù)下降,8 h后又有所增加。從總的趨勢來看,昆蟲取食對H2O2積累的影響大,表明植物對不同損傷形式具有識別能力。

圖2 傷害脅迫對合作楊葉片H2O2含量的影響

2.3 合作楊葉片受損傷后抗氧化酶活性的變化

SOD、CAT和POD是植物細胞中清除活性氧的主要抗氧化酶類,機械損傷和昆蟲取食后,合作楊葉片中3種抗氧化酶活性均發(fā)生變化,但各有其特點(圖3)。機械損傷處理后,損傷葉中SOD活性迅速增加,并在1 h時達到最大值,隨后開始下降,直至恢復(fù)到對照水平。昆蟲取食后,SOD活性在處理初期變化比較平緩,雖有所升高,但增幅不大,到2 h時SOD活性開始迅速上升并達到最大值,隨后迅速下降,在8 h時顯著低于對照。而葉片中CAT活性與對照相比均顯著升高,并隨時間延長呈先上升再下降的趨勢,在處理后2 h時CAT活性達到峰值,隨后開始下降。昆蟲取食后,葉片中CAT活性變化趨勢與機械損傷相似,與對照相比CAT活性變化不顯著;葉片中POD活性隨時間延長無明顯變化,維持在一個相對穩(wěn)定的水平。昆蟲取食后,葉片中POD活性在0.5 h時迅速升高達到最大值,最大增幅為70.4%,之后POD活性有所下降,但仍高于顯著高于對照。

圖3 傷害脅迫對合作楊葉片SOD,CAT,POD活性的影響

3 討論

植物在遭受到損傷時,在其受傷部位會發(fā)生一系列的早期信號事件,ROS的產(chǎn)生是早期信號事件之一。當(dāng)ROS積累超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力時,ROS就會大量積累,造成了抗氧化酶活性的降低和膜透性的增加[12-13]。MDA是膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一,其積累是自由基毒害作用的表現(xiàn)。因此,MDA可以代表細胞的脂質(zhì)過氧化水平和生物膜損傷程度的大小,目前已成為判斷膜質(zhì)過氧化作用的一個重要指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果表明,昆蟲取食后,H2O2含量與對照相比均有顯著的增加,且在取食1 h后迅速升高,并在2 h時達到最大值,隨后迅速下降(圖 2);與之相應(yīng)的,MDA含量也呈先上升后下降趨勢,并在取食2 h后達到最大值,隨后下降,直至恢復(fù)至對照水平(圖1)。機械損傷處理后MDA含量變化趨勢與昆蟲取食一致,但含量顯著低于昆蟲取食;H2O2含量在早期(0.5 h)升高幅度最大,之后持續(xù)下降,8 h后又有所增加。表明機械損傷和昆蟲取食均在一定程度上引起合作楊葉片膜質(zhì)過氧化。

植物在長期進化過程中自身形成了多種機制可以清除活性氧,其中SOD、CAT和POD等抗氧化酶類在植物體內(nèi)協(xié)同作用清除過量的活性氧,SOD可抑制膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的積累,保持和修復(fù)細胞膜;POD可把SOD等產(chǎn)生的H2O2變成H2O,使活性氧維持在較低水平上;CAT可與SOD偶聯(lián),徹底清除體內(nèi)超氧陰離子及H2O2等氧自由基。這些抗氧化酶類在維持活性氧的代謝平衡、保護膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中起重要作用,從而使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫傷害[15]。

在本研究中,傷害脅迫后合作楊葉片內(nèi)各種保護酶活性均受到不同程度的影響,其變化方式因不同損傷形式而異(圖3)。從總體趨勢來看,隨著處理時間延長,抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)呈先升高后下降的變化規(guī)律,表明了它們抗傷害脅迫的協(xié)同性,共同組成防御過氧化系統(tǒng),抵抗不良條件對植物體的破壞。昆蟲取食后,SOD和POD活性隨時間的增加而增加,分別在1 h和2 h時達到最大值,隨后開始下降;CAT活性也表現(xiàn)出相似的趨勢,但與對照相比無顯著變化。機械損傷處理后,合作楊葉片中的SOD和CAT活性隨著損傷時間的延長呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢,在處理末期其活性仍然顯著高于對照;而POD活性隨時間延長無明顯變化,維持在一個相對穩(wěn)定的水平。這些酶活性變化與昆蟲取食和機械損傷后葉片內(nèi)MDA和H2O2積累表現(xiàn)出一致性,從而有效清除ROS,維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定。兩種不同處理方法中,昆蟲取食誘導(dǎo)的膜質(zhì)過氧化和抗氧化酶活性變化與機械損傷誘導(dǎo)結(jié)果表現(xiàn)出明顯差異,這是因為昆蟲取食除了對合作楊葉片造成機械損傷,同時還有其口腔分泌物的參與。表明合作楊遭到傷害脅迫后體內(nèi)H2O2短時間內(nèi)快速積累可能與抗蟲性之間存在著一定關(guān)聯(lián)。

綜上所述,機械損傷和昆蟲取食均能引起合作楊葉片中活性氧迸發(fā),同時又通過誘導(dǎo)抗氧化酶類活性提高,降低膜質(zhì)過氧化水平,進一步誘導(dǎo)傷害防御反應(yīng)產(chǎn)生,為探討合作楊抗蟲性機制從生理生化方面奠定了基礎(chǔ)。

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