苗方 李琳 趙訓(xùn)允 安 蕓

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校 山東 菏澤 274000;①山東省牡丹大藥房)

牡丹皮為毛莨科芍藥屬植物牡丹的干燥根。本品為《中國(guó)藥典》收載品種,性微寒、味苦。具有清熱涼血、活血化瘀之功效[1]。牡丹皮目前正作為一種傳統(tǒng)中藥被日益重視和廣泛使用。經(jīng)藥理研究證明,具有催眠、抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙等作用[2]。在日化方面,可將皮膚中沉積色素還原褐色,使皮膚增白,對(duì)色斑、肌肉痛具有較好治療和保健效果[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道,用高效液相色譜法和差示分光光度法測(cè)定丹皮酚含量的報(bào)道[4]。本文用薄層色譜法結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津 Cs-900型雙波長(zhǎng)薄層掃描儀(日本島津);定量毛細(xì)管(日本島津公司);薄層自動(dòng)鋪板器(重慶南岸新力實(shí)驗(yàn)電器廠);AK-12A型中藥粉碎機(jī)(天津市華航制藥機(jī)械有限公司);超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠);薄層層析用硅膠 G(青島海洋化工廠)。丹皮酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)供含量測(cè)定用,化學(xué)試劑均為分析純;乙醇(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;分析純)。

1.2 牡丹皮的采集方法 采收季節(jié)多在秋分和寒露之間,地上枝葉變黃枯萎時(shí)采挖。將挖出的根用力輾轉(zhuǎn),頂端使根皮一側(cè)破裂,皮心略脫離,一手捻住不裂口的一側(cè),一手捏住木心,將木心順破裂口往下邊拉,邊分離邊剝出,除去木心后順手把根條捻直,并撮合裂縫口,曬干,即為商品“牡丹皮”。產(chǎn)地:樣品采集采自菏澤市牡丹種植基地,藥材均為分株移植 3年的牡丹。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備。取供試藥材樣品,粉碎成直徑不大于 2mm的碎塊,潤(rùn)濕 120min。精密提取 5g,置索氏提取器中,用氯仿 60mL回流提取 10h,提取液減壓濃縮至小體積,用無水乙醇定容于 10mL容量瓶中,作為供試品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密稱取丹皮酚對(duì)照品 5mg,用無水乙醇定容至 10mL,作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3 缺牡丹皮空白對(duì)照液的制備。按處方比例稱取除牡丹皮外的其它藥材,按樣品的制備工藝及樣品溶液的制備方法,制得缺牡丹皮空白對(duì)照溶液10mL。

2.2 薄層層析條件 稱取硅膠 G5g,用 0.3%CMC-Na液14mL在勻漿機(jī)中調(diào)和均勻后,用鋪板器均勻涂鋪于 20cm×20cm薄層板上,厚 0.3mm,自然干燥后在 110℃活化 1.5h,取出置干燥器內(nèi)備用,將樣品與對(duì)照品溶液 5點(diǎn)于同一薄層板上,以環(huán)己烷 -氯仿 -無水乙醇(7:3:1)溶劑系統(tǒng)上展開 10cm,揮干溶劑,于紫外燈 257nm下定位在薄層掃描儀上測(cè)定。

2.3 薄層掃描測(cè)定條件 掃描方式為反波長(zhǎng)反射法,鋸齒掃描:測(cè)定波 長(zhǎng) λs=274nm,參比波長(zhǎng) λR=365nm,掃描速度20mm/min反射鋸齒掃描;夾縫 1.25mm×1.25mm線性參數(shù)Sx=3。

3 結(jié)果

測(cè)得觀賞牡丹皮中丹皮酚含量為 1.46mg/g,加樣回收率為97.60%,變異系數(shù)為 1.15%。

3.1 空白干擾試驗(yàn) 按含量測(cè)定條件,對(duì)點(diǎn)樣層析后的供品、丹皮酚及缺丹皮空白液的各斑點(diǎn)分別在 λs=274nm,λR=365nm進(jìn)行掃描,劃出吸收曲線。結(jié)果表明:缺牡丹皮空白液在與丹皮酚對(duì)應(yīng)位置上無明顯吸收峰,基本上為平線,而標(biāo)準(zhǔn)品、供試品在相應(yīng)位置上有明顯的吸收峰,這表明本測(cè)定無明顯干擾。

3.2 線標(biāo)關(guān)系考察(標(biāo)準(zhǔn)曲線) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,將選定的色譜條件,展開,取出晾干,置紫外燈下檢識(shí)定位,掃描測(cè)定,以點(diǎn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積分值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:丹皮酚在 1～1.5μg范圍內(nèi),點(diǎn)樣量與峰面積積分分值呈良好線性關(guān)系,所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得回歸方程 Y=32316x+6080,相關(guān)系數(shù)r=0.9987表明在其范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,并通過原點(diǎn)。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸收丹皮酚對(duì)照品和供試品溶液于同一塊薄層板上展開,揮于展開劑,立即掃描測(cè)定斑點(diǎn)峰面積值,每隔 0.5h掃描 1次連續(xù) 3h,結(jié)果表明:對(duì)照品和供試品斑點(diǎn)在測(cè)定時(shí)間 100min內(nèi)斑點(diǎn)穩(wěn)定,峰面積積分值基本不變。

3.4 精密度試驗(yàn)

3.4.1 同板精密度試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸收標(biāo)準(zhǔn)品溶液 4μL,供試品溶液 4μL,在同一薄層板上點(diǎn) 5個(gè)相同量的點(diǎn),依法測(cè)定各斑點(diǎn)的斑面積積分值并計(jì)算精密度,結(jié)果見表 1。

表1 同板精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.2 異板間精密度試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 4μL,供試品溶液 4μL,分別點(diǎn)于 5塊薄層板上,每板點(diǎn) 5個(gè)相同量的點(diǎn),依法測(cè)定并計(jì)算各板樣品中丹皮酚的含量。結(jié)果見表 2。

表2 異板精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品約5g,精密稱定,共稱取6份,依法測(cè)定各樣品中丹皮酚的含量,結(jié)果6次測(cè)得平均值為1.165mg/g,變異系數(shù) RSD=1.76%,表明重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取牡丹皮約 5g,分別精密加入丹皮酚對(duì)照品約 3mg,然后按照供試品溶液的制備方法,回收實(shí)驗(yàn)液,依法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)液中丹皮酚含量,并計(jì)算回收率,結(jié)果 5次測(cè)定的平均回收率為 97.60%,變異系數(shù)為 1.15%。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.7 樣品含量測(cè)定 精密吸取 3批供試品溶液各 4μL及丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2、4μL點(diǎn)于同一薄層板上,依法展開,掃描,按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算樣品中丹皮酚含量,結(jié)果見表 4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

丹皮酚為主要有效成分且已成為衡量丹皮質(zhì)量的法定標(biāo)準(zhǔn)之一?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定秋季采取丹皮,當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶一般在立秋后開始采挖。至霜降前采取完畢,在春夏兩季開始正是牡丹生長(zhǎng)發(fā)育高峰期,光合作用旺盛,對(duì)丹皮的產(chǎn)量影響甚大,當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶在采取牡丹根后,用竹片或其它工具刮去根的表皮(即木全皮層)抽去木心,曬干即為刮丹皮,在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)銷售,若只抽去木心,不刮表皮,直接曬干,即為原丹皮主要供外貿(mào)出口[5]。

對(duì)牡丹皮干燥藥材設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察提取條件,考察項(xiàng)目為溶劑(水、乙醇、丙酮)粉碎度(切片、粗粉、中粉)提取方式(回流、超聲、索氏提取)提取時(shí)間(8、10、12h)。結(jié)果表明,最佳提取時(shí)間為 95%乙醇索氏提取 10h。測(cè)量觀賞牡丹皮中丹皮酚的含量,方法簡(jiǎn)便,重現(xiàn)性好,靈敏度高,適用于測(cè)定牡丹皮及其制劑中丹皮酚的含量。自唐代以來,牡丹廣泛種植,山東省是我國(guó)觀賞和藥用牡丹的主產(chǎn)區(qū)之一。曹州菏澤栽培面積近 15萬畝,觀賞品種近千個(gè),年產(chǎn)丹皮近百噸[6]。牡丹皮藥理學(xué)研究表明[7],丹皮酚具有重要的藥理作用。因此,通常以丹皮酚含量作為質(zhì)量控制的主要指標(biāo)[8]。張氏等[9]研究,丹皮酚含量和牡丹皮中另一有效成分芍藥苷呈明顯正相關(guān)。所以本實(shí)驗(yàn)在其它檢測(cè)指標(biāo)符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定時(shí),以丹皮酚含量高低判斷藥材質(zhì)量。為菏澤牡丹皮進(jìn)入臨床提供參考。

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