王 沛，劉章鎖，梁獻(xiàn)慧，駱 紅，馬 瑨，石新慧

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室鄭州450052

持續(xù)存在的白蛋白尿是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展到終末期腎衰竭的危險(xiǎn)因素［1-2］。腎小球?yàn)V過的白蛋白幾乎100%在腎小管重吸收并被分解而回到血液循環(huán)，這種重吸收過程會(huì)消耗大量的能量，而由于腎臟本身結(jié)構(gòu)的因素，腎小管區(qū)域的氧分壓又比較低，因此臨床上低氧張力常同白蛋白過負(fù)荷同時(shí)存在［3］。另外，白蛋白誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞(tubular epithelial cell，TEC)凋亡是造成腎臟纖維化的起始因素［4-5］。白蛋白過負(fù)荷與低氧張力在促進(jìn)腎臟纖維化方面是否存在某些聯(lián)系尚未見報(bào)道。作者觀察了白蛋白聯(lián)合低氧刺激對(duì)TEC凋亡的影響，以探討白蛋白促進(jìn)腎臟損傷的機(jī)制，為臨床干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 去脂的小牛血清白蛋白(美國(guó)Sigma公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)，Trizol(Invitrogen公司)，bax和bcl-2 PCR擴(kuò)增引物、DNA Marker、AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，2.5 g/L胰蛋白酶(杭州吉諾生物公司)。CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus Instruments公司)，MCO-18M Multigas Incubator(日本三洋公司)，IX40型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E，由中山醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院余學(xué)清教授惠贈(zèng))NRK-52E細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)加入100 kU/L青霉素、100 U/mL鏈霉素，以2.5 g/L胰蛋白酶消化后置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并按1∶3進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞均勻接種，生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)加人無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后使用第3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 NRK-52E細(xì)胞凋亡的 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) 以不同質(zhì)量濃度(0、10、20、30和40 g/L)白蛋白下常氧(含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的空氣)條件下孵育NRK-52E細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)的各組細(xì)胞的凋亡率，得到最適合白蛋白質(zhì)量濃度;然后NRK-52E細(xì)胞在最適合白蛋白質(zhì)量濃度和低氧(體積分?jǐn)?shù)為1%O2、5%CO2和94%N2)聯(lián)合條件下刺激24 h，同對(duì)設(shè)常氧對(duì)照組、低氧對(duì)照組和常氧+30 g/L白蛋白培養(yǎng)組。以2.5 g/L胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集各處理組細(xì)胞，用冷 PBS液(pH=7.0)漂洗 2 次，用 200 μL 結(jié)合緩沖液重懸并調(diào)整成1×106mL－1的單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液，加入AnnexinⅤ-FITC和PI各5 μL，混勻后室溫避光反應(yīng) 10 min，再加入 300 μL Binding Buffer，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4 NRK-52E細(xì)胞 bax和 bcl-2 mRNA表達(dá)的RT-PCR法檢測(cè) 各組細(xì)胞分別加入1 mL Trizol，細(xì)胞懸液移入EP管，劇烈振蕩，加入氯仿靜置分層，取水相，異丙醇沉淀抽提總RNA。采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，取總RNA 5 μg，參照操作步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 20 μL。bax上游引物 5’-ACCAAGAAGCT GAGCGAGTGTC-3’，下游引物 5’-ACAAAGATGGT CACTGTCTGCC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為365 bp。bcl-2上游引物 5’-CACCCCTGGCATCTTCTCCTTC-3’，下游引物 5’-CACAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為303 bp。內(nèi)參 GAPDH上游引物5’-AATGCATCCTGCACCACCAA-3’，下游引物序列:5’-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為516 bp。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃3 min;94℃變性45 s，退火溫度bcl-2為67℃，bax為58℃，72℃延長(zhǎng)45 s，共30個(gè)循環(huán);反應(yīng)結(jié)束前72℃ 5 min以充分延伸。取PCR產(chǎn)物10 μL經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，經(jīng)凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行吸光度積分掃描，計(jì)算bcl-2和bax與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析比較不同質(zhì)量濃度白蛋白對(duì)常氧條件下NRK52E細(xì)胞凋亡的影響以及不同處理組NRK-52E細(xì)胞凋亡率、bax mRNA和bcl-2 mRNA表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度白蛋白對(duì)常氧條件下NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響 在常氧條件下，隨著白蛋白質(zhì)量濃度的增加(0、10、20、30 和40 g/L)，NRK52E 細(xì)胞的凋亡率也逐漸增高［(5.23±3.24)%、(9.08±3.67)%、(15.70 ± 3.43)%、(25.59 ± 3.32)% 和(29.12 ±4.29)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.748，P ＜0.001)。

2.2 不同處理組 NRK-52E細(xì)胞凋亡率、bax和bcl-2 mRNA表達(dá)的比較 見圖1、表1。

圖1 不同處理組NRK-52E

表1 不同處理組NRK-52E細(xì)胞凋亡率、bax和bcl-2 mRNA表達(dá)的比較(n=3)

3 討論

Erkan等［6］用不同質(zhì)量濃度的白蛋白培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞LLC-PK1，發(fā)現(xiàn)LLC-PK1細(xì)胞在攝取白蛋白的同時(shí)出現(xiàn)了凋亡增加，并且凋亡的細(xì)胞與攝取白蛋白的細(xì)胞一致。Thomas等［7］應(yīng)用白蛋白腹腔注射造成白蛋白過負(fù)荷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)這些大鼠在出現(xiàn)大量蛋白尿的同時(shí)出現(xiàn)了TEC凋亡。作者的研究結(jié)果顯示白蛋白可誘導(dǎo)NRK-52E凋亡，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。

Bcl家族凋亡蛋白在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［8-9］。有研究［10］認(rèn)為低氧可促進(jìn) TEC 凋亡，其機(jī)制可能與低氧直接降低凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)或Bcl-2/Bax比值有關(guān)，但另一些研究［11］認(rèn)為低氧對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)直接影響。作者的研究結(jié)果顯示低氧本身不增加大鼠TEC的凋亡，但可增強(qiáng)白蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與進(jìn)一步促進(jìn)Bax高表達(dá)和Bcl-2低表達(dá)有關(guān)。

［1］Hemmelgarn BR，Manns BJ，Lloyd A，et al.Relation between kidney function，proteinuria，and adverse outcomes［J］.JAMA，2010，303(5):423

［2］Pavkov ME，Knowler WC，Hanson RL，et al.Predictive power of sequential measures of albuminuria for progression to ESRD or death in Pima Indians with type 2 diabetes［J］.Am J Kidney Dis，2008，51(5):759

［3］Heyman SN，Khamaisi M，Rosen S，et al.Renal parenchymal hypoxia，hypoxia response and the progression of chronic kidney disease［J］.Am J Nephrol，2008，28(6):998

［4］Birn H，Christensen EI.Renal albumin absorption in physiology and pathology［J］.Kidney Int，2006，69(3):440

［5］Ohse T，Inagi R，Tanaka T，et al.Albumin induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in renal proximal tubular cells［J］.Kidney Int，2006，70(8):1 447

［6］Erkan E，Devarajan P，Schwartz GJ.Mitochondria are the major targets in albumin-induced apoptosis in proximal tubule cells［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(4):1 199

［7］Thomas ME，Brunskill NJ，Harris KPG，et al.Proteinuria induces tubular cell turnover:a potential mechanism for tubular atrophy［J］.Kidney Int，1999，55(33):890

［8］楊國(guó)杰，李運(yùn)偉，曾秋棠，等.缺血后處理對(duì)兔缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，43(1):57

［9］汲振余，趙立群，張聚真，等.食管早期癌和癌前病變組織中HIF-1α、Bax和Survivin的表達(dá)對(duì)光動(dòng)力學(xué)療效的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，43(2):205

［10］Yamamoto K，Tomita N，Yoshimura S，et al.Hypoxia-induced renal epithelial cell death through caspase-dependent pathway:role of Bcl-2，Bcl-xL and Bax in tubular injury［J］.Int J Mol Med，2004，14(4):633

［11］Box AH，Yuen C，Ponjevic D，et al.Signaling and apoptosis differences between severe hypoxia and desferoxamine treatment of human epithelial cells［J］.Biochem Cell Biol，2008，86(5):425