5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人蛋白激酶CK2全酶活性的影響*

李春梅1，2)，林小聰2)，劉新光2)#，陳小文2，3)，梁念慈2)
1)廣東藥學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室廣州510006 2)廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所湛江524023 3)深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所深圳518026
#通訊作者，男，1964年10月生，博士，教授，研究方向：生物化學(xué)，E-mail：xgliu64@126.com

蛋白激酶CK2;重組蛋白;全酶;5-氯苯并三唑;酶動(dòng)力學(xué)

目的：觀察5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶動(dòng)力學(xué)機(jī)制。方法：在體外等物質(zhì)的量混合CK2 α’和β亞基構(gòu)成重組CK2全酶。以重組人CK2全酶為分子靶點(diǎn)，通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)移到CK2底物上的γ-32P ATP的32P放射活度來(lái)檢測(cè)不同濃度5-氯苯并三唑?qū)K2活性的影響，并進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果：0、1、3、9、27、81及243 μmol/L的5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人CK2全酶均具有抑制作用，且該作用隨濃度的增加而增強(qiáng)(F= 165.552，P＜0.001)，IC50為20.10 μmol/L;它與ATP呈競(jìng)爭(zhēng)性抑制CK2的活性，抑制常數(shù)Ki為18.63 μmol/L;與酪蛋白呈非競(jìng)爭(zhēng)性抑制CK2的活性，抑制常數(shù)Ki為22.58 μmol/L。結(jié)論：5-氯苯并三唑是重組人蛋白激酶CK2的抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料 5-氯苯并三唑購(gòu)自美國(guó)Aldrich公司;肝素、精胺及ATP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;P81磷酸纖維素濾紙購(gòu)自英國(guó)Whatman公司;γ-32P ATP購(gòu)自北京福瑞生物工程公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。重組人CK2α’和β亞基的原核表達(dá)、純化與鑒定參見(jiàn)文獻(xiàn)［8-10］，將純化的重組人CK2α’與β亞基等物質(zhì)的量混合構(gòu)成重組人CK2全酶。

1.2 5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人CK2全酶活性的影響

將5-氯苯并三唑稀釋到0、1、3、9、27、81及243 μmol/L，每反應(yīng)管加入受試藥物10 μL，再加入反應(yīng)混合液15 μL［含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，150 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，50 μmol/L ATP，γ-32P ATP 1.85×104Bq(比活1.85×1017Bq/mol)，去磷酸化酪蛋白2 g/L］，最后加入重組CK2全酶10 μL，室溫反應(yīng)10 min后取30 μL點(diǎn)至直徑2 cm的P81磷酸纖維素濾紙上終止反應(yīng)，陰干，用85 mmol/ L磷酸洗滌數(shù)次，最后用丙酮洗滌1次，80℃烤干后加閃爍液，液閃儀計(jì)數(shù)。每min催化1 pmol γ-32P ATP上的32P轉(zhuǎn)移到酪蛋白上所需的酶量為1個(gè)酶活性單位(cpm)。根據(jù)半數(shù)效量概率單位法［11］計(jì)算IC50：以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度抑制率的概率單位為縱坐標(biāo)，做圖并求出直線回歸方程，根據(jù)方程計(jì)算IC50值(50%抑制時(shí)的概率單位為5)。

1.3 5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人CK2全酶影響的動(dòng)力學(xué)分析 根據(jù)IC50結(jié)果，選擇3種不同藥物濃度(0，10，40 μmol/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。在固定酪蛋白濃度為2 g/L、ATP濃度為10～80 μmol/L情況下，測(cè)定CK2的活性(相當(dāng)于反應(yīng)速度);或在固定ATP濃度為10 μmol/L、酪蛋白濃度(1～8 g/L)條件下，測(cè)定CK2活性。各分別進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)平行管。采用Lineweaver-Burk做圖法，以1/S和1/V做圖顯示酶的動(dòng)力學(xué)結(jié)果(S表示底物濃度，V表示反應(yīng)速度)，求出酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)表觀米氏常數(shù)Km和表觀最大反應(yīng)速度Vmax，以此判斷5-氯苯并三唑?qū)K2抑制作用的類型;根據(jù)上述動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算得出抑制常數(shù)K［12］。

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1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)不同濃度5-氯苯并三唑作用后重組人全酶活性的影響比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人CK2全酶活性的抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人CK2全酶有較強(qiáng)的抑制作用，該作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)(表1)。根據(jù)效量概率單位法求出的直線回歸方程為：Y=1.117 4X+3.543 2(R2=0.997 9)，其IC50為20.10 μmol/L。

表1 5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人蛋白激酶CK2全酶活性的影響(n=3)

2.2 酶動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 不同濃度ATP條件下5-氯苯并三唑?qū)K2作用的動(dòng)力學(xué)分析 動(dòng)力學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖1，表2。

圖1 不同濃度ATP條件下

表2 不同濃度ATP條件下5-氯苯并三唑?qū)K 2作用的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

可以看出，隨著藥物濃度的增加，Km增大，而Vmax基本不變，雙倒數(shù)作圖的交點(diǎn)位于縱坐標(biāo)上，因此5-氯苯并三唑與ATP呈競(jìng)爭(zhēng)性抑制重組人CK2全酶活性。抑制常數(shù)Ki為18.63 μmol/L。

2.2.2 不同濃度酪蛋白條件下5-氯苯并三唑?qū)K2作用的動(dòng)力學(xué)分析 動(dòng)力學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖2，表3。

圖2 不同濃度酪蛋白條件下

表3 不同酪蛋白濃度條件下5-氯苯并三唑?qū)K 2作用的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

雙倒數(shù)作圖的交點(diǎn)位于橫坐標(biāo)上，因此5-氯苯并三唑與酪蛋白對(duì)重組人CK2活性的作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)Ki為22.58 μmol/L。

3 討論

作者觀察了鹵代苯并三唑衍生物中的一種——5-氯苯并三唑?qū)χ亟M人蛋白激酶CK2全酶的作用，并進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表明，5-氯苯并三唑能明顯抑制蛋白激酶CK2全酶的活性，IC50為20.10 μmol/L;而且它與ATP呈競(jìng)爭(zhēng)性抑制 CK2活性(Ki=18.63 μmol/L)，與酪蛋白呈非競(jìng)爭(zhēng)性抑制CK2活性(Ki=22.58 μmol/L)。5-氯苯并三唑?qū)K2的抑制活性和親和作用小于傳統(tǒng)的CK2抑制劑——5，6-二氯 1-β-D-呋喃核糖苯并咪唑［12］(DRB，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3A，IC50為13 μmol/L，Ki為23 μmol/L)和4，5，6，7-四溴苯并三唑［6］(TBB，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3B，IC50為0.9μmol/L，Ki＜1 μmol/L)。這可能是由它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的：三唑環(huán)取代了咪唑環(huán)，可能增加了其抑制活性;但是鹵素含量減少，可能又降低了其抑制活性。

圖3 2個(gè)有效的CK 2抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

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(2009-03-30收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of 5-chlorobenzotriazole on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme

LI Chunmei1，2)，LIN Xiaocong2)，LIU Xinguang2)，CHEN Xiaowen2，3)，LIANG Nianci2)

1)Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou 510006 2)Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023 3)Paediatrics Institute，Shenzhen Children’s Hospital，Shenzhen 518026

蛋白激酶CK2是一種真核細(xì)胞中普遍存在的第二信使非依賴性蛋白激酶，在腫瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用［1-4］。此外，其在HIV-1復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及裂解細(xì)胞等功能的調(diào)控中起重要作用，一些CK2抑制劑具有抗HIV-1活性［5］。因此認(rèn)為CK2在抗腫瘤及抗病毒藥物研究方面是一個(gè)具有吸引力的分子靶點(diǎn)，其特異性抑制劑具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［6］。目前已知的CK2抑制劑多為ATP-結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，主要包括異喹啉衍生物、鹵代苯并咪唑/苯并三唑衍生物及天然的蒽醌衍生物［7］。CK2在組織細(xì)胞中含量極低，從組織中直接提取純化比較困難。為篩選CK2抑制劑，作者以重組CK2α’亞基與β亞基等物質(zhì)的量混合構(gòu)成的全酶［8-10］作為研究

*廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 05011579;廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目 B2007093

protein kinase CK2;recombinant protein;holoenzyme;5-chlorobenzotriazole;enzyme kinetics

Aim：To observe the direct effect of 5-chlorobenzotriazole on recombinant protein CK2 holoenzyme and its kinetics.Methods：The CK2 α’and β subunits were mixed at the same molar ratio and reconstituted CK2 holoenzyme.The recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme was used as a molecular target.The CK2 activity and its kinetic analysis were assayed by detecting incorporation of32P of［γ-32P］ATP into the substrate in the various conditions.Results：5-chlorobenzotriazole at 0，1，3，9，27，81 and 243 μmol/L inhibited the holoenzyme activity of recombinant human protein kinase CK2，and the effect strengthened with the increase of the concentration(F=165.552，P＜0.001).IC50=20.10 μmol/L.Kinetic studies of 5-chlorobenzotriazole on CK2 showed that the inhibition was competitive with ATP with the Kiof 18.63 μmol/L and noncompetitive with casein with the Kiof 22.58 μmol/L.Conclusion：5-chlorobenzotriazole is an effective inhibitor of CK2 holoenzyme.材料，觀察5-氯苯并三唑(鹵代苯并三唑類衍生物類抑制劑)對(duì)純化的重組人CK2全酶活性的影響，報(bào)道如下。

Q784