楊玲竹，馬麗紅

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科鄭州450052

稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的一種特殊情況，發(fā)病機(jī)制不明。有學(xué)者［1］認(rèn)為細(xì)胞凋亡在胎盤絨毛組織結(jié)構(gòu)分化及功能完善等方面起重要作用，細(xì)胞凋亡的加速可能導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限及早產(chǎn)等病理過(guò)程的發(fā)生。作者檢測(cè)了稽留流產(chǎn)患者絨毛組織結(jié)構(gòu)中Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)和凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)成員 Livin 的表達(dá)，探討兩者與稽留流產(chǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及處理 選擇2008年7月至11月在鄭州大學(xué)第一和第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的稽留流產(chǎn)患者30例作為研究對(duì)象(實(shí)驗(yàn)組)。稽留流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)以人民衛(wèi)生出版社第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》［2］為主。以同期無(wú)合并癥的健康人群行人工流產(chǎn)的早孕婦女30例為對(duì)照組。所有研究對(duì)象無(wú)合并癥，無(wú)全身感染性疾病，月經(jīng)周期規(guī)律，流產(chǎn)前無(wú)用藥史。2組樣本的基本臨床資料如年齡、孕齡、孕產(chǎn)次差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，均為早期流產(chǎn)(孕周＜12周)。2組研究對(duì)象均在確診后第2天行人工流產(chǎn)術(shù)取絨毛組織，用生理鹽水沖洗后，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，固定完全后石蠟包埋，另取一部分存于液氮中備用。

表1 2組一般資料的比較

1.2 FADD及Livin蛋白的檢測(cè) 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)FADD及Livin蛋白的表達(dá)。兔抗人抗FADD多克隆抗體和兔抗人抗Livin多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司，抗體稀釋比例為1∶100。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用試劑盒內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照片為陽(yáng)性對(duì)照，用0.01 mol/L PBS代替一抗作陰性對(duì)照。參照對(duì)照片，F(xiàn)ADD及Livin陽(yáng)性信號(hào)均表現(xiàn)為棕黃色或黃色顆粒狀物，定位于胞質(zhì)。抽取5個(gè)高倍視野，按陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分:陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，＞75%為4分;再按照染色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)著色細(xì)胞為0分，淡黃色著色為1分，棕黃色著色為2分。2項(xiàng)評(píng)分的乘積≥3為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 FADD及Livin mRNA檢測(cè) Trizol提取液和RT-PCR試劑盒均購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。Trizol法抽提絨毛組織中總RNA，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。FADD引物序列:上游 5’-GAGAAG GAGAACGCAACA-3’，下游 5’-GACGCTTCGGAGG TAGAT-3’，產(chǎn)物大小170 bp。Livin引物序列:上游5’-GACGCTTCGGAGGTAGAT-3’，下游 5’-GCACG GCACAAAGACGAT-3’，產(chǎn)物大小 485 bp。β-actin引物序列:上游5’-ATTGGCAATGAGCGGTTCCGC-3’，下游 5’-CTCCTGCTTGCTGATGCACATC-3’，產(chǎn)物大小336 bp，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR條件:94℃預(yù)變性1 min;94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次;最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖(西班牙全式金公司)凝膠電泳，MGIAS-1000凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并拍照。以目的基因條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)2組FADD及Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，對(duì)兩者mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用成組資料設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中FADD及Livin蛋白檢測(cè)結(jié)果 見圖1、表2。

圖1 正常早孕及稽留流產(chǎn)組織中FADD及Livin蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表2 2組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中FADD及Livin蛋白的表達(dá) 例(%)

2.2 2組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中FADD及Livin mRNA檢測(cè)結(jié)果 見圖2、表3。

圖2 FADD及Livin的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

表3 2組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中FADD及Livin mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

FADD是新近克隆出的一種能與Fas相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白，其基因位于人11號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，由死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)和死亡結(jié)構(gòu)域(DD)兩部分組成。FADD基因參與多種死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，其主要作用途徑為:Fas與FasL結(jié)合導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域形成三聚體而活化，并引起與之結(jié)合的FADD構(gòu)象改變，使Caspase-8前體集聚、斷裂和激活，產(chǎn)生有活性的Caspase-8，從而激發(fā)一系列下游的Caspase-3等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［3］。FADD異常導(dǎo)致的凋亡通路異常與多種疾病發(fā)病之間聯(lián)系密切［4-5］。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常早孕絨毛中有FADD的陽(yáng)性表達(dá)，提示FADD與胚胎發(fā)育密切相關(guān)。正常妊娠均存在一定程度的滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，且主要發(fā)生在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，說(shuō)明FADD在胚胎發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用［6］。

Livin是IAPs家族的新成員，主要在一些腫瘤組織中高表達(dá)，正常組織中表達(dá)較少［7］;其BIR功能區(qū)可與Caspase結(jié)合，抑制Caspase的活性，尤其是Caspase-3、-7和Caspase-9，通過(guò)阻斷凋亡受體和以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起作用;抑制腫瘤細(xì)胞中Livin基因的表達(dá)，可增加細(xì)胞的凋亡［8］。Ka等［9］用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞JEG-3和絨毛膜瘤細(xì)胞系Jar中都有Livin mRNA的表達(dá);通過(guò)免疫印跡分析高純化的足月胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Livin在絨毛膜滋養(yǎng)層和間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中都有表達(dá)，而在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)較低。表明細(xì)胞凋亡特別是滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡參與了正常早期妊娠胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育，在胚胎發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用。

作者觀察到實(shí)驗(yàn)組滋養(yǎng)層細(xì)胞FADD蛋白及mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，而Livin蛋白及mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低。表明FADD的高表達(dá)與Livin的低表達(dá)與稽留流產(chǎn)有關(guān)。作者還發(fā)現(xiàn)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中FADD的表達(dá)以合體滋養(yǎng)層細(xì)胞為主，而對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中Livin的表達(dá)以滋養(yǎng)層細(xì)胞為主。

作為胎盤功能的主要承擔(dān)者，絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中的合體滋養(yǎng)細(xì)胞是執(zhí)行功能的分化終末細(xì)胞，凋亡的發(fā)生是其必然結(jié)局。而細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡則可能與絨毛發(fā)育和DNA修復(fù)障礙等有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加，打破了維持絨毛正常發(fā)育的平衡狀態(tài)，勢(shì)必影響其正常功能的發(fā)揮，使絨毛生長(zhǎng)受阻，從而阻礙孕卵的發(fā)育，繼而發(fā)生稽留流產(chǎn)。而Fas凋亡途徑可能是滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的主要途徑。

［1］Vogt Isaksen C.Maternal smoking intrauterine growth restriction，and placental apoptosis［J］.Pediatr Dev Pathol，2004，7(5):433

［2］樂(lè)杰，謝幸，林仲秋，等.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:83

［3］Stewart JH 4th，Nguyen D，Chen GA，et al.Induction of apoptosis in malignant pleural mesothelioma cells by activation of the Fas(Apo-l/CD95)death signal pathways［J］.J Thorac Cardiovase Surg，2002，123(2):295

［4］Trauzold A，Schmiedel S，Roder C，et al.Multiple and synergistic deregulations of apoptosis-controlling genes in pancreatic carcinoma cells［J］.Br J Cancer，2003，89(9):1 714

［5］Tourneur L，Mistou S，Michiels FM，et al.Loss of FADD protein expression results in a biased Fas-signaling pathway and correlates with the development of tumoral status in thyroid follicular cells［J］.Oncogene，2003，22(16):2 795

［6］Yeh WC，Pompa J LDI，Me Curraeh ME，et al.FADD:essential for embryo development and signaling from some but not all，inducers of apoptosis［J］.Sciense，1998，279(5 358):1 954

［7］劉川，吳小候，張唯力，等.Livin反義寡核苷酸誘導(dǎo)人腎癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(17):1 622

［8］郭玥馨，毛成剛，羅慶，等.Livin siRNA重組腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡和耐藥的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，341(14):1 353

［9］Ka H，Hunt JS.Tamporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human in placentas［J］.Am J Pathol，2003，163(2):413