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        豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)研究進展

        2010-06-19 05:25:40蔡家利
        四川畜牧獸醫(yī) 2010年10期
        關(guān)鍵詞:圓環(huán)抗原基因組

        葉 芬,蔡家利

        (1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院,重慶 400715;2.重慶理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400050)

        1 病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼的主要蛋白

        1.1 病毒的基因組結(jié)構(gòu)和特點 PCV基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子,根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核酸序列,將PCV分為PCV1和PCV2兩個血清型。PCV1的基因組全長為1 759bp,基本沒有致病性,PCV2的基因組全長為1767bp或1768bp。兩個血清型的核苷酸的同源性低于80%,由基因序列推出的氨基酸的序列同源性小于76%。PCV2分離株間核苷酸的同源性大于94%,而PCV1分離株間核苷酸的同源性大于99%。

        PCV基因組中含有圓環(huán)病毒所特有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(Stem-loop structure),它是一保守的9核苷酸基序,序列為 TAGTATTAC(PCV1)或 AAGTATTAC(PCV2),這一序列對病毒DNA的復(fù)制非常關(guān)鍵,DNA的環(huán)復(fù)制就是從這里開始。莖環(huán)結(jié)構(gòu)下游有4個六聚體重復(fù)(5′-CGG-CAG-3,H1 H2 H3 H4),這些序列是病毒復(fù)制酶蛋白的結(jié)合位點。

        Hamel等(1998)應(yīng)用軟件對PCV基因組進行分析,發(fā)現(xiàn)PCV1和PCV2均可能含有11個開放閱讀框(ORF)。其中 ORF1、2、3、4、7和 8具有一定的同源性,其余ORFs無任何同源性。編碼的蛋白大小從36 kDa~2 kDa不等。現(xiàn)已證實,PCV有兩個主要的閱讀框:ORF1和ORF2,二者在長度上都大于600bp。ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白,該蛋白氨基酸序列相當(dāng)保守,是PCV1和PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因;而ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap,它是主要的免疫蛋白。

        PCV2基因組的11個閱讀框大小相差懸殊(見表1)。其中 ORF1、ORF5、ORF7、ORF10,5′~3′方向相同;ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11,5′~3′方向相同。這些閱讀框表現(xiàn)為重疊基因,從而充分利用了圓環(huán)病毒有限的遺傳物質(zhì),這可能是生物進化過程中自然選擇的結(jié)果。

        表1 PCV2基因組的閱讀框概況

        1.2 病毒編碼的主要蛋白

        1.2.1 Rep蛋白 Rep蛋白與病毒基因組的滾環(huán)復(fù)制相關(guān),由PCV最大的開放閱讀框ORF1編碼,分子量為 35.6 kDa(PCV1) 或 35.8 kDa(PCV2),由 312 aa(PCV1)或 314 aa(PCV2)組成。PCV1與 PCV2的蛋白氨基酸序列同源性達86%,這也是兩種血清型PCV產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因所在。PCV1的Rep蛋白僅有 1 個糖基化位點,位于 20 aa~22 aa(NPS);PCV2 的Rep蛋白則含有3個糖基化位點,位于23 aa~25 aa(NPS),256aa~258aa(NQT)及 286aa~288aa(ZAT)。Rep蛋白具有與典型滾環(huán)復(fù)制(RCR)相關(guān)的3個保守基序Ⅰ(FTLNN)、Ⅱ(HLQG)、Ⅲ(YCSK)以及結(jié)合 dNTPs的P環(huán)(P-LOOP)結(jié)構(gòu)(序列為G-GKS),這些結(jié)構(gòu)對維持Rep蛋白的功能至關(guān)重要,突變或缺失均會影響病毒的復(fù)制,這也進一步證明了PCV DNA是滾環(huán)式復(fù)制。Rep蛋白在所有圓環(huán)病毒中相對保守。系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析表明,圓環(huán)病毒的Rep蛋白可能是植物病原Nanovirus的Rep蛋白與小RNA樣病毒(如嵌杯樣病毒)RNA結(jié)合蛋白或原核生物的解旋酶發(fā)生重組的結(jié)果。

        1.2.2 Cap蛋白 實驗證明ORF2編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Cap蛋白),它是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,構(gòu)成病毒的核衣殼,在病毒感染細胞后在宿主各種酶的參與下產(chǎn)生。PCV1與PCV2的Cap蛋白均由233aa組成,氨基酸同源性僅為64%。兩種病毒的Cap蛋白都只有單一的糖基化位點,分別位于PCV2 Cap的143 aa~145aa(NYS)及 PCV1 的 102aa~104 aa(NYS)。

        Nawagitgul等將ORF2基因克隆后于昆蟲細胞中表達,表達產(chǎn)物的分子量為30 kμ,與從純化的病毒粒子中監(jiān)測到的蛋白大小相似,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)表達產(chǎn)物能自動組裝成病毒核衣殼樣顆粒,從而進一步證實ORF2基因編碼病毒的核衣殼蛋白。血清學(xué)實驗顯示,兩種血清型的Cap蛋白沒有抗原交叉性,這可能是因為這個共同抗原位點給整個Cap蛋白給掩蓋了。通過多肽掃描還發(fā)現(xiàn),PCV2 Cap蛋白上存在三個特有的抗原位點(65aa~87aa,113aa~139aa及 193aa~207aa),這為建立特異性檢測PCV2的血清學(xué)方法奠定了基礎(chǔ)。目前,對PCV研究較深入的為ORF1和ORF2,同時由于ORF2的以上特性,其編碼產(chǎn)物就成為分子水平上診斷PCV的理想抗原,ORF2也成為研制基因工程疫苗的首選基因。因此,ORF2的研究已成為PCV2研究的熱點。

        2 PCV2分子免疫學(xué)特性

        有研究表明,PCV2能夠在其不復(fù)制或降解的情況下持續(xù)存在于DC細胞中,這種沉默病毒的感染同時提出了免疫逃避和DCs降解機制,而由于具有遷移能力,感染病毒的DCs是一種潛在的可在宿主體內(nèi)不需要復(fù)制就能傳播病毒的工具。Shibahara等也證實PCV2可以誘導(dǎo)淋巴系統(tǒng)中B細胞凋亡,使得抗原遞呈細胞遞呈抗原的能力減弱,同時降低了B淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的機能,因此PCV可以導(dǎo)致豬的免疫抑制。由于PCV2導(dǎo)致細胞因子mRNA表達失調(diào),尤其是胸腺Ⅱ-10mRNA水平上升,必然嚴重損害豬群的免疫系統(tǒng),從而為其他病原的侵襲創(chuàng)造了有利條件。

        3 與分子生物學(xué)相關(guān)的檢測方法研究進展

        3.1 ELISA方法 林彥星等應(yīng)用原核表達的PCV2衣殼(Cap)蛋白作為診斷抗原,初步建立了一種檢測PCV2抗體的間接ELISA方法。實驗表明該方法具有較高的敏感性和特異性,適于大規(guī)模檢測PCV2血清抗體的流行病學(xué)調(diào)查。秦承學(xué)等將PCV2 ORF1和ORF2基因分別插入桿狀病毒和大腸桿菌表達系統(tǒng),用親和層析方法提純獲得重組衣殼(Cap)與復(fù)制(Rep)蛋白,用細胞融合技術(shù)獲得2株Cap和Rep蛋白單克隆抗體,以重組Cap和Rep蛋白作為抗原,通過反應(yīng)重要條件的優(yōu)化,建立了間接ELISA方法,有較好的特異性和重復(fù)性,可用于PCV2抗體檢測和疫苗免疫抗體鑒別診斷。

        3.2 間接免疫熒光試驗(IFA) 1998年Allan等將組織病料在PK215細胞中進行培養(yǎng),用兔抗PCV高免血清培養(yǎng)細胞中的PCV進行反應(yīng),利用間接免疫熒光法對PCV進行檢測和分型。該方法具有良好的特異性和敏感性,可滿足流行病學(xué)調(diào)查、臨床監(jiān)測和疫苗抗體水平檢測的需要。

        3.3 PCR方法 PCR法是一種診斷快速和特異性高的診斷方法。目前用于PCV診斷的PCR法主要有常規(guī)PCR、復(fù)合PCR、套式PCR、競爭PCR等方法。Quintana等對18種豬商品疫苗用PCR檢測PCV1和PCV2,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有疫苗中未含有PCV2 DNA,僅有其中兩種疫苗檢出PCV1。此結(jié)果證明,PCR是檢測疫苗產(chǎn)品中是否含有外源PCV的快速敏感的方法,可用于豬疫苗質(zhì)量控制。馮志新等研究設(shè)計合成了一套引物和TaqMan探針,特異性擴增PCV2-ORF2基因,通過反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了快速定量檢測PCV2的實時PCR方法。該方法具有較好的特異性和重復(fù)性,對PCV2 DNA檢測的下限為1拷貝/μL,敏感性比常規(guī)PCR高106倍。

        目前在規(guī)?;?、集約化豬群中發(fā)生多病原混合感染、繼發(fā)感染的情況越來越常見,其中PCV2、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細小病毒(PPV)是較易混合感染的DNA病毒,常見于臨床病例中。由于多重PCR技術(shù)可在一份樣品中同時檢測多種病原體,且特異性和敏感性高,檢測時間短、成本低,在國外已作為一種新的檢測方法被應(yīng)用于臨床病例的檢測中。Lee Chulseung等構(gòu)建了可檢測和區(qū)分PRV、豬細胞巨化病毒(PCMV)和PCV2的多重PCR方法,此法對其他病毒、細菌和所用的Vero細胞未見有非特異性反應(yīng),適用于檢測供異種組織器官移植的豬樣品中的這些病毒。

        3.4 原位雜交(ISH)技術(shù) ISH具有高度敏感性,在國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種方法。應(yīng)用ISH既可以對PCV1和PCV2進行分型,又可以檢測PCV與其他病毒的混合感染。劉方娜等根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)基因序列,在ORF2內(nèi)設(shè)計1對特異性引物,利用PCR反應(yīng)擴增出371 bp的核酸片段,回收并純化PCR產(chǎn)物,用地高辛標(biāo)記,建立了地高辛標(biāo)記核酸探針診斷PCV2的方法。該探針與8個PCV2重組菌的核酸抽提物均能發(fā)生特異性雜交,而與對照組豬圓環(huán)病毒Ⅰ型(PCV1)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)的核酸雜交均為陰性;對PCV2 DNA的最低檢測量為10pg。

        4 結(jié)語

        自豬圓環(huán)病毒(PCV)發(fā)現(xiàn)以來,各國學(xué)者對其進行了深入研究。目前,PCV2及由其引起的PMWS等疾病已成為當(dāng)今的研究熱點,也取得了不小的進展,但仍有許多問題尚待解決。由于目前仍然無有效的措施來防制豬圓環(huán)病毒病,所以仍需對PCV的分子生物學(xué)特性進行深入研究,以進一步弄清病毒基因組各ORFs及其編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、病毒的免疫學(xué)特性以及病毒的致病機理等,為PCV2的弱毒疫苗、亞單位疫苗以及重組活載體等疫苗的研制奠定堅實的理論基礎(chǔ),力爭從根本上解決該病的防制問題。

        [1]Hamel A L,Lin L L,Nayar G P.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs[J].J Virol,1998,72(6):5262-5267.

        [2]Nawagitgul P,Morozov I,Steven R B,et al.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].J Gen Virol,2000,81:2 281-2287.

        [3]Mankertz A,Mankertz T,Wolf K,et al.Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus[J].J Gen Virol,1998,79:381-384.

        [4]Ilyina T V,Koonin E V.Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replications from eubacteria,eukaryotes and archaebacteria[J].Nucleic Acids Res,1992,20:3279-3285.

        [5]Darwichl L,Pie S,Rovira A,et al.Cytokine mRNA expression profiles in lymphoid tissues of pigs naturally affected by postweaning multisystemic wasting syndrome[J].J Gen Virol,2003,84(8):2 117-2 125.

        [6]林彥星,孫彥偉,劉鎮(zhèn)明,等.應(yīng)用原核表達的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白建立一種間接ELISA診斷方法 [J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2007,29(3):217-221.

        [7]秦承學(xué),姜 平,王先煒,等.表達豬圓環(huán)病毒2型Rep蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定 [J].畜牧與獸醫(yī),2007,39(10):125.

        [8]Quintana J,Segales J,Calsamiglia M,et al.Detection of PCV in commercial pig vaccines using PCR[J].Veterinary Journal,Netherlands,2006,171(3):570-573.

        [9]馮志新,姜 平,王先煒,等.豬圓環(huán)病毒2型TaqMan實時PCR檢測方法的建立 [J].中國病毒學(xué),2006,21(4):371-374.

        [19]Lee C,Moon H J,Yang J,et al.Multip lex PCR for the simultaneous detection of pseudorabies virus,porcine cytomegalovirus and porcine circovirus in pigs[J].Journal of Virological Methods,2007,139(1):39-43.

        [11]劉方娜,刁有祥,王 妮,等.豬圓環(huán)病毒2型地高辛標(biāo)記探針檢測方法的建立與應(yīng)用 [J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2008,28(7):771-774.

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