鄢郁霖，王小蓉，唐海東，藍(lán)麗，李煥秀，賀忠群，湯浩茹

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安，625014）

倍性育種常常是育種學(xué)家進(jìn)行植物種質(zhì)改良的重要途徑。同源四倍體的植株多在產(chǎn)量、品質(zhì)或抗性等方面優(yōu)于其二倍體。多倍體也是遺傳學(xué)和育種學(xué)研究中重要的中間材料，如用來(lái)作親本，可提高遠(yuǎn)緣物種間的可雜交性，另外，同源多倍體與原二倍體雜交，獲得各種非整倍體后可進(jìn)行該物種部分性狀基因定位和連鎖遺傳分析等研究[1]。

秋水仙素是從百合科秋水仙 （Colchicum autumnateL.）的營(yíng)養(yǎng)器官和種子里提煉出來(lái)的一種倍性誘變劑，其作用機(jī)制在于阻止處于有絲分裂中期的細(xì)胞形成紡錘絲，使染色體不能分向兩極，導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞停留在中期，從而產(chǎn)生染色體加倍的核，這個(gè)核也不能形成隔膜，當(dāng)秋水仙素的作用被解除后，受影響的細(xì)胞就產(chǎn)生了加倍效應(yīng)，而后經(jīng)選擇培育便可獲得多倍體植株[2]。用秋水仙素合成同源多倍體，在葉菜類[3～4]、茄果類[5～6]、根菜類[7]和瓜類[8～11]等蔬菜中都有成功報(bào)道。迄今國(guó)內(nèi)對(duì)黃瓜倍性誘變的研究中，只有對(duì)同源四倍體的合成條件作初步說(shuō)明或鑒定[9～11]。本文擬通過(guò)用不同濃度秋水仙素處理露地黃瓜干種子和萌動(dòng)種子，探索秋水仙素對(duì)黃瓜生長(zhǎng)及發(fā)育的誘變效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2006年3月中旬到5月下旬在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝場(chǎng)進(jìn)行。材料為露地黃瓜品種CU901，購(gòu)自甘肅蘭州豐田種苗有限公司，為二倍體。

表1 秋水仙素誘導(dǎo)黃瓜的效應(yīng)

1.2 試驗(yàn)方法

①材料處理 取CU901種子，用紗布包好，放在清潔的水中浸泡3~4 h。把種子去水甩干，置于27~30℃條件下進(jìn)行催芽，在催芽過(guò)程中常翻動(dòng)種子，待種子露出0.5~1.0 cm長(zhǎng)胚根時(shí)停止催芽[12～13]。

在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以4 h為處理時(shí)間，用0.005%，0.2%，0.4%，0.8%四種濃度梯度的秋水仙素溶液浸泡黃瓜干種子和已露出0.5~1.0 cm胚根長(zhǎng)的萌動(dòng)種子各55粒，同時(shí)以蒸餾水處理為對(duì)照。4 h后，用自來(lái)水沖洗種子，直到?jīng)_洗干凈為止。然后將處理后的種子播入營(yíng)養(yǎng)缽，并放入培養(yǎng)箱進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，溫度保持在22~26℃。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，移入試驗(yàn)地定植。

②秋水仙素誘變效應(yīng)的田間觀測(cè) 待幼苗長(zhǎng)出后，分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照和每個(gè)處理的成活株數(shù)，計(jì)算對(duì)照和每個(gè)處理的萌芽率 （萌芽株數(shù)/處理株數(shù)）；待植株長(zhǎng)成后，分別觀察統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的變異株數(shù)，計(jì)算對(duì)照和每個(gè)處理的變異率（植株形態(tài)發(fā)生變異的株數(shù)/處理株數(shù)）。

植株長(zhǎng)成后，觀察記錄不同處理中每株的第一雌花節(jié)位，并測(cè)定莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)、葉柄粗、第1~5節(jié)每節(jié)的節(jié)間長(zhǎng)等指標(biāo)；每株分別取3朵當(dāng)天開(kāi)放的雄花，測(cè)定花萼長(zhǎng)、花瓣長(zhǎng)和寬；每株分別取3朵當(dāng)天開(kāi)放的雌花，測(cè)定花萼長(zhǎng)、花瓣長(zhǎng)和寬、子房長(zhǎng)和直徑；每株取3條商品瓜測(cè)量其果梗長(zhǎng)、瓜長(zhǎng)、直徑、果形指數(shù)等指標(biāo)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

③植株的細(xì)胞學(xué)鑒定 在形態(tài)學(xué)初步篩選的基礎(chǔ)上，取1.5~3 mm長(zhǎng)的卷須進(jìn)行壓片制作[14～15]，再進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理染色體數(shù)目加倍的植株的數(shù)目，計(jì)算加倍率，加倍率（%）=加倍株數(shù)/處理株數(shù)×100%。

④花粉形態(tài)觀察及其可染力測(cè)定 參考熊慶娥[16]的方法，于晴天上午8：00左右，取當(dāng)天開(kāi)放的雄花進(jìn)行可染性的觀察和統(tǒng)計(jì)。取少許黃瓜花粉放在干潔的載玻片上，加1~2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察，凡是被染成藍(lán)色的為含有淀粉的活力較強(qiáng)的花粉粒，呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉粒。觀察2~3張片子，每片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉的可染率，可染率（%）＝呈藍(lán)色的花粉粒數(shù)/該視野總花粉粒數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理誘變黃瓜的效果

本試驗(yàn)從550株CU901黃瓜植株中篩選到5株（占 1%）同源四倍體（2n=4x=28）植株，秋水仙素浸萌動(dòng)種子比浸干種子誘導(dǎo)同源四倍體的效果更好，2種處理方式的植株萌芽率大體上是隨著處理濃度的升高而降低，變異率均隨處理濃度的升高而升高，其中浸萌動(dòng)種子的變異率更高。2種處理均只有濃度為0.8%的處理出現(xiàn)倍性變異（2x→4x），并且0.8%濃度的秋水仙素浸萌動(dòng)種子加倍效果顯著高于浸干種子，其加倍率為7.27%。

從生長(zhǎng)勢(shì)的差異來(lái)看，經(jīng)秋水仙素處理后的干種子和萌動(dòng)的種子出苗明顯減慢且長(zhǎng)勢(shì)不如對(duì)照植株，并且，秋水仙素濃度越高，對(duì)植株的抑制作用越明顯。用0.8%秋水仙素處理的有些植株嚴(yán)重畸形，甚至死亡。所有植株開(kāi)花均延后，部分植株甚至不見(jiàn)其開(kāi)花。由此可見(jiàn)，雖然較高的秋水仙素濃度能誘導(dǎo)較高的變異，加倍效果最好，但由于其毒害過(guò)重而導(dǎo)致植株成活率明顯下降。

表2 對(duì)照與最適的秋水仙素濃度處理后的黃瓜莖、葉及果實(shí)形態(tài)特征比較

表3 對(duì)照與最適的秋水仙素濃度處理后的黃瓜雄花和雌花形態(tài)特征比較

2.2 不同濃度秋水仙素處理黃瓜后形態(tài)特征變化

不同濃度秋水仙素處理黃瓜后在形態(tài)上與對(duì)照有很大差異。與對(duì)照相比，秋水仙素處理的植株側(cè)枝數(shù)減少、節(jié)間變短、莖變細(xì)、葉面積變小、葉柄長(zhǎng)度變短、葉柄變細(xì)；雄花花瓣變長(zhǎng)、第一雌花節(jié)位降低、雌花花瓣變長(zhǎng)變寬、子房變短、子房直徑變小、結(jié)果數(shù)減少、果形指數(shù)減?。ū?和表3）。而二倍體植株和四倍體植株相比較，在葉片、雌花和果實(shí)上又有明顯的不同：四倍體植株葉面積明顯變大、葉色變濃、葉片變厚、葉緣呈明顯皺褶；四倍體雌花花瓣明顯增大、萼片變長(zhǎng)、子房直徑明顯增大；幼果果刺、果棱、果梗、瓜柄均更顯突出，果實(shí)的果形指數(shù)明顯減小（圖 1-A，B，C，D）。

2.3 同源四倍體與二倍體黃瓜染色體及花粉活力的比較

對(duì)黃瓜卷須進(jìn)行壓片，觀察染色體數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理染色體數(shù)目加倍的植株的數(shù)目，可清晰看到黃瓜二倍體植株有14條染色體，而同源四倍體植株有28條染色體（圖1-G和 H），當(dāng)切片中大部分細(xì)胞都有28條染色體時(shí)，則可認(rèn)為是同源四倍體植株。對(duì)CU901黃瓜二倍體和同源四倍體的花粉進(jìn)行比較鑒定，在顯微鏡下觀察到，二倍體的花粉粒大小一致，滴上I2-KI溶液后，絕大部分被染成藍(lán)色，可染率高，達(dá)95%；而四倍體黃瓜花粉粒大小不一致，多畸形，滴上I2-KI溶液后，很多都是呈黃色的發(fā)育不良的花粉粒，可染率為51%，顯著低于二倍體（圖1-E和 F）。

圖1 CU901二倍體與同源四倍體的部分形態(tài)學(xué)特征和體細(xì)胞染色體比較A：二倍體植株；B：同源四倍體植株；C：二倍體與四倍體的雌花比較（左為二倍體，右為四倍體）；D：二倍體與四倍體的果形比較（上為二倍體，下為四倍體）；E、F：二倍體和四倍體植株的花粉；G、H：二倍體和四倍體植株染色體 （2n=4x=28）

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)用秋水仙素處理CU901黃瓜萌動(dòng)種子共獲得5株同源四倍體，其中，0.8%秋水仙素浸泡萌動(dòng)種子4 h，加倍率可達(dá)7.27%，效果最好。研究結(jié)果表明，不同秋水仙素濃度處理相同時(shí)間，濃度越高，對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的抑制作用也越強(qiáng)，且畸變率增強(qiáng)，成活率下降，因此必須選擇適宜濃度對(duì)黃瓜進(jìn)行處理。

本試驗(yàn)在春季大棚里進(jìn)行，溫度保持在20℃以上，可能較有利于誘變的四倍體細(xì)胞保持良好的分裂生長(zhǎng)，而由于種子萌動(dòng)階段的細(xì)胞處于代謝及合成的旺盛時(shí)期，這一時(shí)期體細(xì)胞易于發(fā)生突變，因此用秋水仙素浸泡黃瓜萌動(dòng)種子取得了較好的誘導(dǎo)加倍效果。

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