閔凡祥，王曉丹，胡林雙，魏 琪，董學(xué)志，劉偉婷，郭 梅

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

由致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.)de Bary引起的晚疫病是目前危害馬鈴薯生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一[1]。每年因此病的發(fā)生導(dǎo)致全世界損失約 170億美元，我國(guó)損失約10億美元[2]。馬鈴薯晚疫病菌具有A1和A2兩種交配型，一旦兩種交配型同時(shí)存在，通過異宗配合進(jìn)行有性生殖，從遺傳學(xué)角度分析，意味著馬鈴薯晚疫病菌適應(yīng)性和變異性將更強(qiáng)，并且，有性生殖產(chǎn)生卵孢子，卵孢子能夠在土壤中越冬，成為次年主要的初侵染源。而且，卵孢子多集中在較低部位葉片，從而避開殺菌劑，且對(duì)殺菌劑也不敏感，使得化學(xué)防治更加困難。因此，A2交配型的出現(xiàn)對(duì)抗病育種和晚疫病藥劑防治提出了新的挑戰(zhàn)。黑龍江省是我國(guó)重要的馬鈴薯種薯、商品薯及加工原料薯的生產(chǎn)基地之一，馬鈴薯晚疫病每年均有發(fā)生，并造成巨大損失，嚴(yán)重制約我省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。黑龍江省一旦存在A2交配型，那么對(duì)晚疫病抗病育種和晚疫病藥劑防治工作將更加艱難，其傳統(tǒng)防治策略和方法均要作出相應(yīng)的調(diào)整。因此，開展馬鈴薯晚疫病菌A2交配型的研究，明確A2交配型在黑龍江省的存在與否，對(duì)提高黑龍江省馬鈴薯晚疫病抗病育種，促進(jìn)馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)展，尤其是對(duì)晚疫病防治策略和方法均具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基

黑麥培養(yǎng)基用于馬鈴薯晚疫病菌的分離培養(yǎng)、保存和鑒定交配型，其制備方法參考Caten等[3]。

1.1.2 交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株

A1交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株來自北京、A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株來自荷蘭，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病害標(biāo)本的采集

2004～2009年在黑龍江省各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)，為大興安嶺、嫩江、訥河、克山、海倫、綏棱、綏化、巴彥、呼蘭、哈爾濱等地的馬鈴薯田塊采集晚疫病病葉。用消毒小刀在健康薯塊上切一小口，然后在田間將病葉的單個(gè)病斑剪下并夾入薯塊中，最后用吸水紙和線繩包扎好后放入紙袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 病原菌的分離、純化

將分離的病原菌在18℃下黑暗培養(yǎng)5～7 d，用滅菌水洗下孢子囊。將孢子囊懸浮液在4℃下黑暗處理1 h促進(jìn)游動(dòng)孢子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)游動(dòng)孢子濃度至每毫升103個(gè)孢子囊，用移液槍吸取200 μL游動(dòng)孢子囊懸浮液均勻涂布在黑麥培養(yǎng)基平板上，18℃下黑暗培養(yǎng)24 h，待游動(dòng)孢子萌發(fā)長(zhǎng)出芽管后在10×40倍顯微鏡下用消毒解剖刀挑取單個(gè)萌發(fā)的孢子至黑麥培養(yǎng)基平板上，5～7 d后即可在平板上形成小菌落，挑取菌落邊緣菌絲塊轉(zhuǎn)移至黑麥培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)保存待試。

1.2.3 交配型的鑒定

采用對(duì)峙培養(yǎng)技術(shù)鑒定各菌株的交配型。將標(biāo)準(zhǔn)菌株和待測(cè)菌株分別預(yù)培養(yǎng)，然后取待測(cè)菌株的菌絲塊單獨(dú)培養(yǎng)及分別與A1和A2標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙培養(yǎng)，菌絲塊之間距離1.5 cm。在18℃黑暗條件下培養(yǎng)2周后，在顯微鏡下觀察各待測(cè)菌株單獨(dú)培養(yǎng)及與標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落交界處是否產(chǎn)生卵孢子。若待測(cè)菌株單獨(dú)培養(yǎng)能產(chǎn)生卵孢子，說明該菌株自交可育；若單獨(dú)培養(yǎng)和與A2配對(duì)不產(chǎn)生卵孢子，與A1配對(duì)產(chǎn)生卵孢子，說明該菌株為A2交配型。

2 結(jié)果與分析

2004～2009年對(duì)采集的病菌，進(jìn)行分離和單孢純化后，最后獲得124個(gè)菌株，其中:克山14個(gè)；海倫11個(gè)；訥河3個(gè)；大興安嶺2個(gè)；哈爾濱35個(gè)；呼蘭7個(gè)；雙城4個(gè)；綏化13個(gè)；巴彥13個(gè)；綏棱8個(gè)；望奎5個(gè)；林口5個(gè)；嫩江4個(gè)。研究表明，所測(cè)試的124個(gè)菌株單獨(dú)培養(yǎng)均未觀察到產(chǎn)生卵孢子，說明在這些菌株中不存在自交可育的菌株。此外，這些菌株與A1標(biāo)準(zhǔn)菌株配對(duì)也未觀察到卵孢子產(chǎn)生，而與A2配對(duì)在菌落交界處均產(chǎn)生了大量卵孢子，說明在測(cè)試的124個(gè)菌株中沒有A2交配型，均為A1交配型（表1，圖1、2）。

表1 2004～2009年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌交配型的鑒定Table1 Identification of mating type of P.infestans isolates collected from Heilongjiang Province from 2004 to 2009

圖1 對(duì)峙培養(yǎng)Figure1 Dual culture

圖2 對(duì)峙培養(yǎng)產(chǎn)生卵孢子Figure2 Oospores formation in dual culture

3 討論

晚疫病菌屬于異宗配合卵菌，其交配型有A1和A2兩種，A1交配型存在歷史較久，A2交配型直到1956年才在墨西哥被發(fā)現(xiàn)[4]。1984年，晚疫病菌A2交配型在瑞士被報(bào)道[5]，這是A2首次出現(xiàn)在墨西哥以外的地方。自此不斷有國(guó)家報(bào)告A2交配型的出現(xiàn)，到目前為止，A2交配型已傳播至歐洲、非洲、亞洲等許多國(guó)家[6-7]。中國(guó)是否受到A2交配型的侵入一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界十分關(guān)注的問題，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)張志銘教授等[8]1995年從內(nèi)蒙古和山西分離到了P.infestans A2交配型。1999年趙志堅(jiān)等[9]在云南省發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌A2交配型。2000年朱杰華等[10]報(bào)道了我國(guó)的河北、內(nèi)蒙、四川、云南均存在馬鈴薯晚疫病菌A2交配型，并推斷在我國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)可能已普遍存在A2交配型。黑龍江省是否具有A2交配型，金光輝等[11]對(duì)黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的交配型進(jìn)行研究，研究顯示黑龍江省還沒有發(fā)現(xiàn)A2交配型，但據(jù)其研究馬鈴薯晚疫病生理小種結(jié)果顯示，黑龍江省馬鈴薯生理小種由簡(jiǎn)單到復(fù)雜，因此，推斷很可能存在A2交配型。

本研究集中2004～2009年采集菌株，對(duì)黑龍江省A2交配型進(jìn)行研究，研究表明，至今還未發(fā)現(xiàn)馬鈴薯A2交配型。因此防治馬鈴薯晚疫病重點(diǎn)將是防止晚疫病菌A2交配型的侵入，加強(qiáng)植物檢疫工作，嚴(yán)格禁止從已發(fā)現(xiàn)A2交配型的疫區(qū)調(diào)入種薯，繼續(xù)對(duì)全省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)進(jìn)行A2交配型的監(jiān)測(cè)。

[1]宋伯符,王軍,張志銘,等.我國(guó)馬鈴薯晚疫病的研究進(jìn)展和建議[J].馬鈴薯雜志,1996,10(3):138-141.

[2]Fry W E,Goodwin S B.Historical and recent migrations of Phytophthora infestans:chronology,pathways and implications[J].Plant Disease,1993,77:653-661.

[3]Caten C E,Jinks L L.Spontane ous variability of Phytophthor infestans.I.cutural variation[J].Can J Bot,1968,46:329-348.

[4]Niederhauser J S.The blight,the blighter,and the blighted[J].Transactions of the New York Academy of Science,1956,19:55-63.

[5]Zhang Z M,Li Y Q,Tian S M,et al.The occurrence of potato late blight pathogen(Phytophthora infestans)A2 mating type in China[J].Journal of Agricultural University of Hebei,1996,19(4):62-66.

[6]Dehal K L,Goth R W,Young R.Occurrence of the A2 matingtype of Phytophthora infestans in potato fields in the United States and Canada[J].American Potato Journal,1991,68:717-725.

[7]Mosa A A,Kato M,Kobayashi N K,et al.Occurrence of the A2 mating type of Phytophthora infestans on potato in Japan[J].Phytopath Soc Japan,1989,55:615-620.

[8]張志銘,李玉琴,田世民.中國(guó)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)A2交配型[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,16(4):63-65.

[9]趙志堅(jiān),何云昆,李成云,等.云南省發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)A2交配型[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1999,12(3):1-3.

[10]朱杰華,張志銘,李玉琴.馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)A2交配型的分布[J].植物病理學(xué)報(bào),2000,30(4):375.

[11]金光輝,白雅梅,孫秀梅,等.黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌A2交配型的測(cè)定[J].中國(guó)馬鈴薯,2006,20(4):212-214.