胡宏波,賈安平,梁秀蘭,劉振鵬,楊 建,詹前美

(柳州鐵路中心醫(yī)院:1.檢驗科;2.消化內(nèi)科,廣西 545007)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細胞(CD4+CD25+regulatory T cell,Treg)是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞群,是健康個體T細胞庫的組成成分,占CD4+細胞5%～10%[1]。該細胞群在自身免疫耐受的維持中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者中Treg數(shù)目增加,其增加能引起患者生存率下降,并且與患者預(yù)后呈負相關(guān)[2]。應(yīng)用抗CD25抗體清除Treg,能夠在荷瘤小鼠體內(nèi)引起有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,使其存活期延長,表明Treg與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[3]。因此,作者通過檢測胃癌組織中T reg分布數(shù)量的改變,并以正常組織作為對照,進一步研究T reg在胃癌免疫中的作用。

1 臨床資料

1.1 一般資料 胃癌組:本院2007年1月至2009年1月手術(shù)切除的15例胃癌標(biāo)本;對照組:15例正常胃組織來源于同期因非腫瘤性疾病行胃大部分切除距病變邊緣2cm正常組織。所有標(biāo)本均在手術(shù)切除后迅速凍存于液氮中,然后置于-80℃低溫保存。全部病例術(shù)前均未行放、化療,術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 抗人 PE-cy5-CD4、FITC-CD25、PE-CD25單抗及同型對照小鼠IgG1抗體購自美國Becton Dickinson公司,CytodetectTM胞內(nèi)細胞因子刺激/染色試劑盒、抗IL-10-PE、TGF-β-PE單抗及同型對照IgG1抗體均購自荷蘭IQ公司,MagCellect人Treg免疫磁珠細胞分選試劑盒購自美國R&D公司,NycoprepTM 1.077密度梯度分離液購自挪威Axis-Shield公司,RPMI l640培養(yǎng)基〔含100mg/L鏈霉素、1×105u/L青霉素、10%胎牛血清(澳大利Invitrogen公司)、5×10-5mol/L 2-巰基乙醇〕購自美國Gibco公司,FACSCalibur型流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 流式細胞儀檢測T reg 剪碎胃組織,37℃消化2h(消化液含1mg/mL膠原酶、2.5u/mL透明質(zhì)酸酶、0.1mg/mL DNase),尼龍網(wǎng)過濾,經(jīng)密度梯度離心法分離出單一核細胞。在上述細胞中,胃癌組加入PE-cy5-CD4單抗、FITC-CD25單抗;對照組加入等量FITC標(biāo)記同型對照小鼠IgG1,振蕩混勻,室溫暗處孵育20min,PBS洗滌,上機檢測。

1.4 Treg的分離、純化 用冷免疫磁珠分選緩沖液調(diào)整分離出的單一核細胞為(1～2)×107/mL,取2mL細胞懸液加入CD4+T細胞生物素化混合抗體,置冰箱孵育15min后加入被鏈霉親和素包被的磁珠,混合反應(yīng)15min,將試管水平放置于磁分離架上,陰性選擇獲得 CD4+T細胞,再按每1×107細胞加入磁珠標(biāo)記抗CD25單抗,陽性選擇獲得CD4+CD25+T細胞,通過流式細胞儀分析細胞純度。

1.5 Treg內(nèi)細胞因子檢測 取24孔細胞培養(yǎng)板,每孔加入經(jīng)免疫磁珠分選法分離、純化得到的Treg(2×106/mL)懸液1mL,共6孔,往誘導(dǎo)白介素-10(IL-10)產(chǎn)生孔加入10μ L巴豆脂(PMA)、10μ L艾羅霉素、10μ L莫能星;往誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)產(chǎn)生孔加入 20μ L PMA 、10μ L 艾羅霉素、10μ L 莫能星。37℃、5%CO2飽和水汽培養(yǎng)箱孵育5h,使IL-10產(chǎn)生達高峰;孵育24h,使TGF-β產(chǎn)生達高峰。經(jīng) HBSS洗滌、4%冷多聚甲醛固定細胞、細胞表面抗原染色、細胞破膜、胞內(nèi)細胞因子染色后,進行流式細胞儀檢測,用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù),以熒光抗體染色陽性細胞百分率記錄結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,所有數(shù)據(jù)以表示,組間均數(shù)比較采用 t檢驗,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃組織中Treg表達比較 胃癌組Treg表達率為(11.51±0.64)%,對照組為(8.40±0.52)%;胃癌組 Treg分布數(shù)量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見圖1。

圖1 胃組織中Treg表達的比較

表1 Treg抑制性細胞因子表達水平(%,n=20)

表1 Treg抑制性細胞因子表達水平(%,n=20)

*:與對照組比較,P＜0.05。

CD4+CD25+IL-10+CD4+CD25+TGF-β+組別未刺激 PMA刺激 未刺激 PM A刺激對照組 0.35±0.071.14±0.33 0.09±0.040.67±0.22胃癌組 0.39±0.062.39±0.36* 0.19±0.200.94±0.09*

圖2 Treg抑制性細胞因子IL-10分泌水平

2.2 T reg抑制性細胞因子的表達 分選出的Treg純度大于89%。兩組比較,刺激前 T reg內(nèi)IL-10、TGF-β分泌水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);經(jīng)體外PMA和艾羅霉素刺激后,胃癌組T reg內(nèi)IL-10及TGF-β分泌水平均比對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見表2和圖2、3。

圖3 Treg抑制性細胞因子 TGF-β分泌水平

3 討 論

正常情況下天然產(chǎn)生的Treg在機體內(nèi)主要作用是動態(tài)調(diào)節(jié)機體免疫平衡,防止免疫反應(yīng)無限制擴大及抑制自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。然而,在腫瘤患者的腫瘤組織、腫瘤浸潤淋巴細胞或外周血中T reg數(shù)目增加,并且Treg增加與患者生存率下降有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)給鼠接種腫瘤或自身抗原后,誘導(dǎo)出大量活化Foxp3+T reg,同時提高了該鼠對于化學(xué)誘導(dǎo)致癌以及接種成瘤的敏感性和腫瘤轉(zhuǎn)移率[4-5];如果選擇性清除T reg,則致瘤敏感性和腫瘤轉(zhuǎn)移率與正常鼠無差異;同樣Treg數(shù)量增加可以加快移植瘤生長速度,降低胃癌細胞凋亡,說明Treg在體內(nèi)也能抑制機體對腫瘤的殺傷活性[6]。上述現(xiàn)象表明,Treg能通過不同機制抑制一系列免疫反應(yīng),促使腫瘤細胞免疫耐受、逃逸,其機制可能涉及以下幾個方面:TCR信號所激活的Treg能夠抑制 CD4+CD25-和CD8+T細胞活化、增殖,并且這種抑制作用為非抗原特異性[7];Treg具有抑制NK細胞增殖、細胞因子分泌和細胞毒作用,以及對單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞等免疫活性細胞起抑制或殺傷作用[8-9];Treg通過分泌IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子和細胞接觸依賴的抑制途徑,抑制免疫效應(yīng)細胞功能等[10];而封閉Treg功能后,免疫活性細胞的活性得以釋放,且殺傷活性明顯增強,同時,Treg分泌的抑制性細胞因子表達下調(diào)[11-12]。

本研究結(jié)果顯示胃癌組織內(nèi)Treg分布數(shù)量明顯高于對照組。同時,通過免疫細胞磁珠分選出高純度 Treg,經(jīng)體外PMA和艾羅霉素刺激活化后產(chǎn)生多種細胞因子(如IL-10、TGF-β等),同時用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑——莫能星抑制細胞分泌細胞因子至胞外,使其在胞內(nèi)高爾基體積聚,以利于細胞因子的檢測。本研究還發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+IL-10+T細胞、CD4+CD25+TGF-β+T細胞數(shù)量在胃癌組中明顯增加,說明活化后的T reg可通過分泌IL-10和TGF-β來抑制Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、Th2介導(dǎo)的抗體產(chǎn)生以及CD8+細胞毒性T細胞的活化[13]。IL-10可通過直接和間接機制明顯降低抗原特異性T細胞增殖。IL-10對T細胞的直接作用包括抑制IL-2的產(chǎn)生以及延長細胞增殖周期等;間接機制包括下調(diào)單核細胞CD80、CD86以及CD28的配體表達和有效抑制IL-12的產(chǎn)生,而IL-12是TH1細胞分化的關(guān)鍵因子;此外,IL-10還可阻止T細胞受體介導(dǎo)的CD4+T細胞活化。TGF-β家族成員也是維系Treg數(shù)量和功能的重要因子[14];它還能誘導(dǎo)表達Foxp3,使外周CD4+CD25+初始 T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)?T reg[15];有研究表明,TGF-β家族成員可以通過劑量依賴方式,在體內(nèi)外促進Treg轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Foxp3T細胞,后者被認為是真正起作用的Treg,從而實現(xiàn)對T reg的反饋調(diào)節(jié)作用[16-17]。TGF-β也可通過抑制免疫效應(yīng)細胞的增殖、分化以及抑制細胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮作用。由此可知,Treg在胃癌中通過分泌抑制性因子等,使胃癌細胞從機體抗腫瘤免疫反應(yīng)體系中逃逸,從而促進胃癌的形成與發(fā)展。

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