熊坤林,楊清武,熊任平

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院:1.放射科;2.神經(jīng)內(nèi)科;3.野戰(zhàn)外科研究所第六研究室,重慶400042)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是發(fā)生于老年和老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,臨床上表現(xiàn)為隱襲起病、進(jìn)行性發(fā)展的記憶減退、認(rèn)知、語(yǔ)言障礙及人格改變等。其特征性病理學(xué)改變是大腦皮層和皮層下結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neuofibrillary tangle,NFT)、細(xì)胞外大量老年斑(senile plaque,SP)形成及神經(jīng)元缺失等[1-3]。其已成為繼心臟病、癌癥和中風(fēng)之后第4位死因。神經(jīng)毒性β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)在腦內(nèi)的聚集和異常沉積是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。AD醫(yī)學(xué)影像學(xué)診斷尚無(wú)突破性進(jìn)展,為研制一種敏感且具有高血腦屏障的分子特異性探針——腐胺-釓-β淀粉樣蛋白(putrescine-Gadolinium-amylor-β peptide,PUT-GD-Aβ),該 分子探針既可特異性標(biāo)記AD的 β淀粉樣斑塊(β-amyloid plaques),也因?yàn)榻饘籴彾a(chǎn)生M RI下可見(jiàn)的對(duì)比增強(qiáng),可用于AD的影像診斷和鑒別診斷[4]。本研究擬在大腸桿菌中高效表達(dá)并純化人源性β淀粉樣蛋白 1-42(Aβ1-42),為該標(biāo)記探針的制備提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株 表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)購(gòu)自美國(guó)Novagen公司,大腸埃希菌BL21(DE3)株由本室保存。

1.2 主要試劑及引物合成、測(cè)序 高保真KOD-plus Taq酶、限制性內(nèi)切酶 NcoⅠ、Bam HⅠ、Mag Extractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit試劑盒購(gòu)自日本Toyobo公司,T4 DNA連接酶購(gòu)自上海生物工程公司,DNA Marker及蛋白Marker購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司,PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Roche公司,Aβ1-42蛋白單克隆抗體6E10(針對(duì)Aβ1-17)購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司,熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司,DNA片段和引物合成及DNA測(cè)序由上海生工提供服務(wù)。

1.3 人源性Aβ1-42蛋白編碼區(qū) DNA片段的獲取 Aβ1-42蛋白為酶降解的β淀粉樣前體蛋白(homo sapiens amyloid precursor protein,APP)的616-657位氨基酸序列。根據(jù)該段蛋白的編碼區(qū)序列(Gen Bank中的登錄號(hào)為NM_001136130)設(shè)計(jì)3條DNA片段,經(jīng)退火延伸后形成Aβ1-42蛋白的編碼雙鏈DNA 序列。 片段1:5′-gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa tt-3′(正鏈),片段 2:5′-cct ttg ttt gaa ccc aca tct tct gca aag aac acc aat ttt tga tga tga act-3′(負(fù)鏈),片段3:5′-cgc tat gac aac acc gcc cac cat gag tcc aat gat tgc acc ttt gtt tga acc cac-3′(負(fù)鏈),3條DNA片段的退火反應(yīng)體系為片段 1、2、3(10mmol/L TE 溶解,終濃度為 10μ mol/L)各8μ L,10×PCR Buffer 2.5μ L,MgCl22.0μ L,dN TPs 2.0μ L,KOD-plus Taq酶 1.0μ L,ddH2O 18.5μ L。熱循環(huán)參數(shù)為 94℃、2min;(94℃、20s,55℃、20s,72℃、30s)×20循環(huán);72℃、3min。所獲產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的片段,稀釋后用作下一步PCR模板,擴(kuò)增獲得目的片段。擴(kuò)增引物為上游引物:5′-tat acc atg gat gca gaa ttc cga cat ga-3′(下劃線部分為 NcoⅠ位點(diǎn),加黑部分為起始密碼),下游引物:5′-ttc gga tcctta cgc tat gac aac acc gcc-3′(下劃線部分為Bam HI位點(diǎn),加黑部分為終止密碼)。PCR反應(yīng)體系(25.0μ L)為退火的模板 DNA回收物(1∶100稀釋)1.0μ L,10×PCR Buffer 2.5μ L,M gCl22.0 μ L,dNTPs 2.0μ L,KOD-plus Taq 酶 0.2μ L,上游引物(10μ M)1.0μ L,下游引物(10μ M)1.0μ L,ddH2O 15.3μ L 。 熱循環(huán)參數(shù)為 94℃、2min;(94℃、20s,55℃、20s,72℃、30s)×32 循環(huán);72℃、3min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳,回收目的片段,作下一步的酶切和連接反應(yīng)。

1.4 重組質(zhì)粒pET-28a-Aβ1-42的構(gòu)建

1.4.1 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切反應(yīng) 將上一步驟中所回收純化Aβ 1-42的 PCR產(chǎn)物和 pET-28a(+)質(zhì)粒作 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切反應(yīng),反應(yīng)體系見(jiàn)表1。置 37℃、3h反應(yīng)。酶切產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,回收目的片段,作下一步的連接反應(yīng)。

表1 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切反應(yīng)體系(μ L)

1.4.2 連接反應(yīng) 反應(yīng)體系為pET-28a(+)/NcoⅠ、Bam HⅠ雙酶切產(chǎn)物(約 1μ g/μ L)3.0μ L,Aβ1-42/Nco Ⅰ 、Bam H Ⅰ雙酶切產(chǎn)物(約 1μ g/μ L)2.0μ L,Ligation high 反應(yīng)液 5.0μ L,總體系10.0μ L。置 16℃、1h反應(yīng)。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)。

1.5 Aβ1-42蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) 用常規(guī)CaCl2法制備BL21感受態(tài)。取10μ L上一步驟的連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化到100μ L BL21感受態(tài)細(xì)胞中,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與IPTG和X-gal涂布于LB(Kanr)平板上,37℃過(guò)夜孵育。挑選陽(yáng)性克隆,提取重組質(zhì)粒。陽(yáng)性重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-Aβ1-42作 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切鑒定后,再作DNA測(cè)序鑒定。挑選重組質(zhì)粒序列完全正確的陽(yáng)性重組菌,于 Kanr的LB液體中,37℃、160rpm離心,培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.6～0.8時(shí),加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 6h,培養(yǎng)物離心,沉淀用 SDSPAGE上樣緩沖液裂解,作 15%T ricine-SDS-PAGE電泳,凝膠掃描成像。對(duì)照菌為不含插入基因的質(zhì)粒pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌。

1.6 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定 收集誘導(dǎo)表達(dá)后菌體,PBS混懸,超聲破菌,15 000g離心10min,分別收集上清液和沉淀。裂菌液上清液及沉淀溶解液取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.7 重組表達(dá)蛋白的純化 表達(dá)蛋白的C-端含6×His標(biāo)簽,故采用日本 Toyobo生物公司的MagExtractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit試劑盒進(jìn)行純化。參照試劑盒說(shuō)明書中可溶性蛋白和包涵體不溶性蛋白的純化方法分別進(jìn)行。所獲產(chǎn)物作15%T ricine-SDS-PAGE電泳。

1.8 表達(dá)蛋白的Western blot鑒定 純化蛋白作SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印PVDF膜,按照參考文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。一抗和二抗的結(jié)合和反應(yīng)參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ1-42蛋白編碼片段的獲得 通過(guò)3個(gè)合成單鏈DNA片段的退火,獲得126bp的 Aβ1-42蛋白編碼序列,進(jìn)一步經(jīng)PCR擴(kuò)增,獲得兩端分別含NcoⅠ、Bam HⅠ酶切位點(diǎn)的DNA片段,同時(shí)加入起始密碼和終止密碼,瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖1。

圖1 Aβ1-42蛋白編碼片段 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒pET28a(+)-Aβ1-42經(jīng)NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切后電泳圖

2.2 pET28 a(+)-Aβ1-42重組質(zhì)粒雙酶切及核苷酸測(cè)序鑒定 將Aβ 1-42蛋白編碼序列片段PCR產(chǎn)物作NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切后回收純化,與經(jīng)同樣雙酶切的pET28a(+)質(zhì)粒回收產(chǎn)物連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取轉(zhuǎn)化平板上的單個(gè)菌落,提取重組質(zhì)粒pET28a(+)-Aβ1-42,采用NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切鑒定,酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,見(jiàn)圖2。重組質(zhì)粒中可切出預(yù)期大小的片段(Aβ1-42蛋白編碼序列理論值約為130bp)。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序,結(jié)果表明,重組質(zhì)粒的序列和閱讀框均完全正確。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ彩圖3。

2.3 pET28(a)-Aβ1-42表達(dá)形式的判定及表達(dá)蛋白的純化將篩選到的陽(yáng)性pET28(a)-Aβ1-42工程菌加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。可見(jiàn)明顯的約4.5×103表達(dá)蛋白條帶,與理論預(yù)期值相符。進(jìn)一步采用MagExtractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit進(jìn)行純化后得到高純度目的蛋白,經(jīng)凝膠電泳后掃描,其純度為55%,為進(jìn)一步的GST純化和 Thrombin切出成熟的 Aβ1-42表達(dá)蛋白提供了基礎(chǔ),見(jiàn)圖3。

圖3 exCAR表達(dá)蛋白的純化結(jié)果

2.5 純化表達(dá)蛋白的Western blot鑒定 純化表達(dá)蛋白的Western blot結(jié)果見(jiàn)圖4。在約6×103位置出現(xiàn)明顯特異性陽(yáng)性條帶,說(shuō)明表達(dá)蛋白確為人源性Aβ1-42蛋白。

圖4 純化表達(dá)蛋白的Western blot鑒定

3 討 論

AD是引起癡呆最常見(jiàn)的疾病之一,大概占癡呆病因的50%～60%,在西方發(fā)達(dá)國(guó)家AD在60～64歲年齡組的發(fā)病率不到1%,但在85歲及其以上的人群中發(fā)病率呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)(24%～33%);在發(fā)展中國(guó)家AD的發(fā)病率有所降低,但卻有60%AD患者是分布在發(fā)展中國(guó)家的,目前AD成為威脅公眾健康的主要疾病,2001年全世界AD患者2 400萬(wàn),隨著人類壽命的延長(zhǎng),到2040年估計(jì)將有8 100萬(wàn)AD患者[1-2]。其已成為繼心臟病、癌癥和中風(fēng)之后第4位死因。

AD的診斷除常規(guī)行為學(xué)檢查外,輔助診斷方法有神經(jīng)心理學(xué)檢查、生化指標(biāo)檢查、電生理學(xué)檢查、神經(jīng)影像學(xué)檢查等,而其中神經(jīng)影像學(xué)檢查對(duì)病情和病程的判斷和預(yù)后最為直接和重要[6]。由于診斷和鑒別診斷困難,醫(yī)學(xué)影像學(xué)的AD研究很受限制,目前臨床上對(duì)于AD的影像學(xué)診斷多停留在腦容量測(cè)量(估計(jì)腦萎縮程度)或通過(guò)MR頻譜分析成像(M RS)對(duì)物質(zhì)新陳代謝率及葡萄糖代謝等間接檢測(cè)水平上[7-8]。近年來(lái)隨著分子影像學(xué)的發(fā)展及MR儀器分辨率的不斷提高,特別是MR顯微成像技術(shù)的發(fā)展,為AD的明確診斷及病變過(guò)程的追蹤及定量監(jiān)測(cè)、治療效果的評(píng)判開(kāi)辟了一條嶄新的道路。

本研究擬研制一種敏感的分子特異性探針(PUT-GDAβ),其可以特異性標(biāo)記AD的β淀粉樣斑塊并因?yàn)槠渑c金屬釓的連接而產(chǎn)生M RI下可見(jiàn)的對(duì)比增強(qiáng),其研究進(jìn)展將對(duì)未來(lái)AD的診斷及治療產(chǎn)生直接深刻的影響[4]。首先,該標(biāo)記法可用于AD疾病的早期發(fā)現(xiàn)和明確診斷;其次,可用于對(duì)疾病的發(fā)展過(guò)程進(jìn)行追蹤,并且對(duì)于常用的抑制Aβ生成或減少淀粉負(fù)擔(dān)的治療措施的療效進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)。這種方法可以解決以往療效評(píng)估無(wú)明確定量指標(biāo)、療效觀察所需時(shí)間長(zhǎng)(往往需要幾個(gè)月)等難題。

Aβ是一系列含39～43個(gè)氨基酸的肽,為 APP的水解產(chǎn)物。APP在β分泌酶作用下生成APP-C99,后者在γ分泌酶復(fù)合體作用下形成長(zhǎng)度不等的 Aβ片段,包括 Aβ 42、Aβ43和Aβ40[9]。人Aβ1-42蛋白為酶降解的APP的616～657位氨基酸序列,其全部氨基酸序列為 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。理論相對(duì)分子質(zhì)量約為4.5×103,人源性β淀粉樣A4前體蛋白序列在GenBank中的登錄號(hào)為NM_001136130。通常在研究工作中,往往采用多肽合成的方法獲得Aβ 1-42肽,但這種方法仍存在一些問(wèn)題,如價(jià)格昂貴、難以保存為 Aβ 1-42單體形式、Aβ1-42在多肽合成儀上屬于難合成肽等。因此,本研究采用大腸桿菌表達(dá),通過(guò)3條DNA片段合成獲得 Aβ 1-42蛋白編碼區(qū)片段,連接至表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)中,在大腸桿菌BL21株中獲得了表達(dá),并通過(guò)純化蛋白的Western blot進(jìn)一步鑒定了該表達(dá)蛋白,但該蛋白的表達(dá)形式為包涵體。

通常來(lái)說(shuō),絕大多數(shù)外源性蛋白在大腸桿菌中會(huì)形成包涵體,其形成的原因還不甚明了,但是普遍認(rèn)為是由于重組蛋白在宿主菌中表達(dá)時(shí),缺乏某些蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中所需要的酶或分子伴侶等,所以無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因造成的。當(dāng)外源蛋白表達(dá)量過(guò)高、重組蛋白含硫氨基酸過(guò)高、重組蛋白的等電點(diǎn)與胞內(nèi)pH接近及重組蛋白為異源性蛋白時(shí),更容易形成包涵體[10]。本研究曾采用一些措施,一是降低誘導(dǎo)劑濃度,如將IPTG終濃度降至0.1mmol/L;二是降低誘導(dǎo)時(shí)工程菌的培養(yǎng)溫度,如在25℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo),以降低工程菌合成外源性蛋白的速度,以期獲得可溶性的表達(dá)蛋白,但均未成功。這可能與表達(dá)蛋白的特性有關(guān)[5]。由于pET表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞為改造后λ噬菌體CE6感染的大腸桿菌BL21溶源菌株,該菌株的基因組中整合有l(wèi)aco調(diào)控的T7 RNA聚合酶基因,這種嚴(yán)格的雙重調(diào)控可以確保表達(dá)載體中目的基因的嚴(yán)格誘導(dǎo)性表達(dá),有效避免目的蛋白質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用而引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定性[11]。

本研究所獲得的基因工程化Aβ1-42蛋白,N-端含載體序列編碼的6×His和GST標(biāo)簽,采用鎳株法一步純化,獲得的蛋白分子質(zhì)量約為6×103,與理論相對(duì)分子質(zhì)量相符。本研究為下一步采用GST標(biāo)簽純化和 Thrombin切出4.5×103的Aβ1-42蛋白及PUT-GD-Aβ的制備提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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