靳 勝,陳書恩,張 曼,張 敏,張秀敏,郝 林,許華林

(1.北京世紀(jì)壇醫(yī)院臨檢中心 100038;2深圳羅湖婦幼保健院檢驗(yàn)科 518019)

多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)無關(guān)、作用機(jī)制亦各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性,這是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象,是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的最主要原因[1],90%以上腫瘤患者的死亡都與腫瘤耐藥性有關(guān)。姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚類色素,由于其色澤穩(wěn)定且毒性低,目前已廣泛用于食品添加劑中。姜黃素具有廣泛的藥理作用,有研究表明,姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用,其機(jī)制可能為誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻斷腫瘤細(xì)胞的生長信號(hào)傳導(dǎo)通路和抑制腫瘤血管生成等多種因素;同時(shí)有學(xué)者認(rèn)為,它還具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。本實(shí)驗(yàn)分別選擇實(shí)體瘤(乳腺腺癌M CF-7/ADR,表達(dá) Mdr1以及 M RP基因)和白血病(急性早幼粒細(xì)胞白血病HL60/ADR,表達(dá)M RP基因)2個(gè)細(xì)胞系觀察姜黃素在體外能否逆轉(zhuǎn)多藥耐受糖蛋白 P-gp、MRP介導(dǎo)的耐藥性并初步探討其可能的機(jī)制,為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 姜黃素、阿霉素(ADM)為國產(chǎn)試劑,PRMI-1640、小牛血清購自Gibco公司。MTT為Sigma產(chǎn)品,RTPCR試劑盒為華美公司產(chǎn)品,引物由北京奧科生物公司合成。

1.2 細(xì)胞生長抑制試驗(yàn) 按MT T法進(jìn)行[2],取1×105/mL的細(xì)胞,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔180μ L,培養(yǎng)24h后加入20μ L 不同濃度的 ADR(0.05、0.1、0.25、1.5、2.5g/L)以及姜黃素(25μ mol/L),對(duì)照組 1加 20μ L生理鹽水,對(duì)照組 2單獨(dú)加入姜黃素,對(duì)照組3僅加阿霉素繼續(xù)培養(yǎng)72h,再向每孔加入20μ L MTT,避光孵育4h后,1 000×g離心10min,棄上清液,每孔加入 100μ L DMSO,震蕩混勻后于酶標(biāo)儀 490nm(630nm校準(zhǔn))處測(cè)定吸光度(A),計(jì)算抑制50%細(xì)胞生長的藥物濃度值IC50,并計(jì)算逆轉(zhuǎn)指數(shù)。

細(xì)胞存活率(IC)=實(shí)驗(yàn)組平均A值/陰性對(duì)照組平均A值。逆轉(zhuǎn)指數(shù)(RI)=IC50(耐藥細(xì)胞+ADR)/IC50(耐藥細(xì)胞+ADR+CUR)。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液成1×108/mL,24h后加入阿霉素1.72μ mol/L(1g/mL)以及阿霉素和姜黃素,在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),使用10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞,70%的冰乙醇固定過夜,50g/mL的RNase 37℃處理 1h,100g/mL的碘化丙啶(PI)4℃、染色30min,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ADM藥物濃度測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液成1×108/mL,加入 1μ g/mL的 ADM,350目尼龍網(wǎng)過濾,于1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀測(cè)定,由于阿霉素有天然的熒光顯色的性質(zhì),激發(fā)波長為 488nm,接收波長為575nm,觀察熒光強(qiáng)度并以此為依據(jù)評(píng)價(jià)藥物濃度。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)耐藥基因表達(dá) 將兩種細(xì)胞系分別收集并提取RNA,使用RNA提取試劑盒、AM V第一鏈cDNA合成試劑盒提取RNA和反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再經(jīng)PCR擴(kuò)增,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像分析儀照相并分析結(jié)果。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。以β-actin為內(nèi)對(duì)照,合成Mdr1、MRP引物[2-3],進(jìn)行 RT-PCR,掃描灰度,計(jì)算目的基因與β-actin的灰度比值[4]。

Mdr1 引物 :5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′;5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT CA-3′;片段長 157bp;PCR條件:94℃、40s,56℃、1min,72℃、1min,擴(kuò)增 30個(gè)循環(huán)。MRP 引物 序列:5′-ACA CTC CAC AGA TCA CTC-3′;5′-CAT GGT GCA GGG TCT ACG-3′;片段長290bp;PCR條件:94℃、45s,55℃、45s,72℃、45s,擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)。β-actin 的引物[4]:5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3′;5′-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3′,片段長 292 bp;PCR 條件:94℃、40s,58℃、1min,72℃、1min,擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)。

1.6 Western blot檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞系HL60/ADR和 MCF-7/ADR培養(yǎng) 24h,再加入阿霉素 1.72μ mol/L(1μ g/mL)和姜黃素(25μ mol/L)聯(lián)合作用24h后提取總蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白定量,取50μ g蛋白加入4×SDS凝膠加樣緩沖液中,100℃加熱10min以使蛋白質(zhì)變性。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)PVDF膜。用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果,并確定蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)位置。用5%脫脂牛奶封閉2h電泳轉(zhuǎn)膜加一抗、二抗DAB染色,檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá),分析差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果取3次測(cè)定的平均值,進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 生長抑制試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)照組顯示姜黃素對(duì)細(xì)胞生長無毒性,單獨(dú)的姜黃素細(xì)胞存活率在95%以上,排除了姜黃素對(duì)細(xì)胞的毒性作用;結(jié)果顯示對(duì)于非耐藥細(xì)胞系,加入姜黃素后IC50無明顯差異,而耐藥細(xì)胞系在加入姜黃素后IC50有顯著性差異,逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為4.18(HL60/ADR)和3.39(MCF-7/ADR),見表 1。

表1 姜黃素、ADM對(duì)不同細(xì)胞系的生長抑制試驗(yàn)結(jié)果(n=3,μ mol/L)

表1 姜黃素、ADM對(duì)不同細(xì)胞系的生長抑制試驗(yàn)結(jié)果(n=3,μ mol/L)

細(xì)胞系 ADM ADM+curcumin HL60/ADR 28.450±7.11 6.800±2.240 HL60 0.101±0.04 0.114±0.030 MCF-7/ADR 18.440±2.98 5.440±1.900 MCF-7 1.310±0.19 1.190±0.550

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 由于細(xì)胞固定后質(zhì)膜通透性升高,降解的DNA釋放,因此DNA組方圖出現(xiàn)二倍體峰(G0/G1期細(xì)胞)的減少,并在G0/G1期峰的左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體峰,即凋亡峰(Ap峰)。同時(shí)加入姜黃素和ADR的HL60/ADR和MCF-7/ADR均出現(xiàn)凋亡,數(shù)值分別為 35.15%和27.48%,而單獨(dú)使用1.72μ mol/L(1μ g/mL)的阿霉素處理后,HL60/ADR和MCF-7/ADR的凋亡細(xì)胞百分比僅為4.11%和3.08%。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明姜黃素加入后可在體外誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡,對(duì)細(xì)胞多藥耐藥有逆轉(zhuǎn)作用。

2.3 細(xì)胞內(nèi)藥物濃度 HL60/ADR和MCF-7/ADR細(xì)胞分別經(jīng)1μ g/mL的ADM、ADM 和姜黃素聯(lián)合作用1h后,流式細(xì)胞儀測(cè)得細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度有顯著性差異;同時(shí)加入阿霉素和姜黃素的試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯高于單獨(dú)使用ADM的試驗(yàn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見表2和圖1。

2.4 耐藥基因以及 Bcl-2蛋白檢測(cè)結(jié)果 HL60/ADR和MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)ADM和姜黃素聯(lián)合作用1h后提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR細(xì)胞M dr1基因表達(dá)降低不明顯(HL60/ADR細(xì)胞系本身不表達(dá) Mdr1基因),檢測(cè)MCF-7/ADR以及HL60/ADR細(xì)胞系的M RP基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)下調(diào)顯著,見圖2;Bcl-2蛋白在兩種細(xì)胞系中經(jīng)加入姜黃素后表達(dá)均明顯降低,見圖3。這些結(jié)果說明耐藥逆轉(zhuǎn)的作用靶點(diǎn)可能是M RP基因,并且有促進(jìn)凋亡的作用。

表2 ADM、姜黃素作用不同細(xì)胞系后細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度

圖1 流式細(xì)胞儀測(cè)得不同細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度

圖2 M RP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 Bcl-2蛋白Western Blot檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚類色素,主鏈為不飽和脂族及芳香族基團(tuán)。目前認(rèn)為其具有抗炎、抗菌、保肝、治療創(chuàng)傷、抗癌、抗病毒等活性[5]。有文獻(xiàn)表明,姜黃素對(duì)人類惡性腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)分化和增殖抑制作用[6],并且可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,與絲裂霉素等抗腫瘤藥物具有協(xié)同作用[7-8]。并且可以抑制血管的生成,有研究顯示它也是抗致突變劑。由于上述原因,其抗癌作用近年來受到重視,有資料顯示姜黃素能抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物乳腺癌、皮膚癌的發(fā)生,縮小瘤體大小并可顯著降低小鼠膀胱移植癌的成瘤率。因其不良反應(yīng)小,被認(rèn)為是一種有廣泛應(yīng)用前景的抗癌新藥,美國國家腫瘤研究所已將其列為第3代癌化學(xué)預(yù)防藥。而且目前普遍認(rèn)為對(duì)這類藥物的研究不僅可以開拓它本身的應(yīng)用領(lǐng)域,還可為設(shè)計(jì)更理想的新藥提供新的獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu),后者可被用為創(chuàng)制新藥的先導(dǎo)化合物,經(jīng)驗(yàn)表明這種做法可以更經(jīng)濟(jì)的篩選發(fā)現(xiàn)新藥。在抑制腫瘤的同時(shí),有研究認(rèn)為該藥物還具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)姜黃素同時(shí)可以在體外有效逆轉(zhuǎn)某些實(shí)體瘤(乳腺腺癌 MCF-7/ADR)和白血病(急性早幼粒細(xì)胞白血病HL60/ADR)細(xì)胞系的多藥耐藥,姜黃素組和阿霉素組的敏感性分別比對(duì)照組增加3.39倍和4.18倍。根據(jù)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果,其逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)可能為M RP基因,同時(shí)細(xì)胞系的凋亡也可能通過Bcl-2蛋白途經(jīng)得到了加強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制很多,但一般認(rèn)為藥泵是其主要并且是最易進(jìn)行逆轉(zhuǎn)的途徑;Mdr1以及MRP基因的編碼產(chǎn)物為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過外排泵作用使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降導(dǎo)致耐藥[9-10],通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MRP基因在兩種耐藥細(xì)胞系中表達(dá)均有所下調(diào),而流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入姜黃素后的細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯高于單獨(dú)使用阿霉素的試驗(yàn)組,說明姜黃素可能通過抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的藥泵功能使藥物有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部達(dá)到治療的結(jié)果。同時(shí)其抑制效應(yīng)不但作用于實(shí)體瘤細(xì)胞而且作用于白血病細(xì)胞系,提示姜黃素的作用不僅僅是針對(duì)某一類腫瘤(實(shí)體和血液病),其具有較好的廣譜逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)顯示,姜黃素對(duì)耐藥細(xì)胞系有明顯的促凋亡作用,并對(duì)Bcl-2蛋白的表達(dá)有所抑制。姜黃素能否在體內(nèi)試驗(yàn)中同樣逆轉(zhuǎn)多藥耐藥,以及是否通過促進(jìn)凋亡以及抑制藥泵在體內(nèi)起到逆轉(zhuǎn)耐藥作用還需進(jìn)一步研究。

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