毛成毅,鄭繼軍,杜 娟,馬 瑜,林 俐,李增鵬,陳 芳

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.病理科;2.腫瘤中心,重慶400042)

原癌基因Src在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用,其異常表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在人類許多腫瘤中(如結(jié)腸癌、乳腺癌和胰腺癌)都存在Src蛋白的過(guò)度表達(dá)和活化。肝癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是臨床上治療肝癌失敗的重要因素。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明,許多肝癌組織中存在高度活化的Src蛋白,然而其在肝癌中的作用還未完全闡明[1-3]。本文中應(yīng)用免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)以及MTT法檢測(cè)Src蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)以及細(xì)胞增殖和凋亡情況,同時(shí)用特異性Src蛋白酪氨酸激酶抑制劑PP2作用于肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞,研究Src蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染科惠贈(zèng);(2)DMEM培養(yǎng)基,小牛血清,胰蛋白酶,PBS;(3)兔抗人單克隆抗體Src(Cell Signaling公司);(4)PP2(Calbiochem公司);(5)羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉公司);(6)SP免疫組化試劑盒(北京中山公司);(7)MTT,DMSO(Sigma公司);(8)倒置顯微鏡(Olympuls公司);(9)6、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司);(10)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);(11)AnnexinV/FITC及PI試劑盒(北京晶美生物有限公司);(12)DMN-9602酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1.2 免疫組化染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞,以0.25%胰酶消化傳代后,加至24孔板中經(jīng)酸和乙醇處理的蓋玻片上。待HepG2細(xì)胞在蓋玻片表面貼附適當(dāng)后,置37℃、5%CO2孵箱孵育 24h 后,按照 5、10、20、40μ mol/mL 4種濃度PP2分別加入培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,倒去培養(yǎng)基,加95%酒精室溫固定30min后取出蓋玻片用DPX粘在載玻片上,4℃冰箱過(guò)夜。用3%過(guò)氧化氫處理10min,再用PBS洗后,依次滴加一抗(1∶300,37℃恒溫箱孵育40min)、增敏劑、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶300,37℃恒溫箱孵育30min)。PBS洗后,以 DAB顯色、蘇木素襯染,然后常規(guī)脫水、封片,用光鏡觀察結(jié)果。

1.3 M TT法檢測(cè)PP2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為5×105/mL,接種于 96孔培養(yǎng)板中,每孔 200μ L。24h后,棄原培養(yǎng)液,按照 5、10、20、40μ mol/mL 4種濃度的 PP2 加入新培養(yǎng)液,每種濃度設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔,另設(shè)陰性對(duì)照組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)48h,各孔加入 MT T(5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清液,然后加入DMSO,振蕩 10min,用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值(波長(zhǎng)=490nm)。根據(jù)下列公式計(jì)算各濃度對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率:平均細(xì)胞增殖抑制率IR=(1-處理組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。以抑制劑濃度為橫坐標(biāo),增殖率為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集不同濃度PP2處理48h的HepG2細(xì)胞,常規(guī)胰酶消化后,制成單細(xì)胞懸液,離心后棄上清液,再經(jīng)預(yù)冷的 PBS洗2次,按 AnnexinV/FITC及 PI試劑盒提供方法依次加入結(jié)合緩沖液、AnnexinV/FITC及PI,4℃避光30min后上機(jī)測(cè)試。采用FACScort流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),每次計(jì)細(xì)胞數(shù)10 000個(gè),激發(fā)波長(zhǎng)488nm,用分析軟件Cell Quest計(jì)算凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 Src蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá) Src蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于HepG2細(xì)胞的細(xì)胞漿,陽(yáng)性著色為棕黃色顆粒狀。PP2抑制劑 5、10、20、40μ mol/mL 分別處理 HepG2 細(xì)胞后,Src 蛋白在HepG2細(xì)胞中表達(dá)降低,棕黃色顆粒狀減少,顏色變淺,見圖1。

圖1 正常HepG2細(xì)胞、陰性對(duì)照及不同 PP2濃度下Src蛋白在HepG2細(xì)胞中表達(dá)情況

2.2 細(xì)胞凋亡分析 PP2作用于HepG2細(xì)胞 48h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)到細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞凋亡率隨著PP2濃度增高而增高。處理組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),低濃度組與高濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見圖2。

圖2 PP2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡情況

圖3 不同濃度PP2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用

2.3 M TT法檢測(cè)PP2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用HepG2細(xì)胞經(jīng)PP2抑制劑 5、10、20、40μ mol/mL 4種濃度作用48h后,隨著抑制劑濃度的增加,抑制作用明顯增加,呈現(xiàn)濃度依賴性,5、10、20、40μ mol/mL 4 種濃度的抑 制率分別為39.66%、48.00%、64.63%、76.89%,低濃度組(5、10μ mol/L)與高濃度組(20、40μ mol/L)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖 3。

3 討 論

肝細(xì)胞性肝癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,隨著慢性肝炎、肝硬化發(fā)生率的提高,HCC的發(fā)病率也不斷上升。雖然目前肝癌診斷治療水平有提高,但其治療效果仍不理想。因此,需要進(jìn)一步闡明HCC的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái),許多證據(jù)表明癌基因Src蛋白在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。Src蛋白是由原癌基因c-Src編碼的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為60kd的磷酸化蛋白質(zhì),是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌蛋白。Src蛋白在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的發(fā)育、增殖和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。在惡性腫瘤細(xì)胞中Src蛋白大量聚集在核周,而在正常的細(xì)胞內(nèi)Src蛋白相對(duì)均勻的散布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。目前研究發(fā)現(xiàn)Src蛋白在結(jié)腸癌中活性極高,尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移到肝臟之后[4-7]。

本實(shí)驗(yàn)證明了Src蛋白在人肝癌HepG2細(xì)胞中高表達(dá),Src酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2抑制HepG2細(xì)胞中Src蛋白酪氨酸激酶后,Src蛋白在人肝癌HepG2細(xì)胞中表達(dá)降低,細(xì)胞中棕黃色細(xì)顆粒狀減少。HepG2細(xì)胞被Src酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2抑制后,培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞偽足減少,增殖顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性,隨著抑制劑濃度的升高細(xì)胞增殖隨之降低。作者發(fā)現(xiàn),應(yīng)用特異性Src蛋白酪氨酸激酶抑制劑PP2能夠抑制HepG2細(xì)胞,使 Src蛋白失活,從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。并且隨著抑制劑濃度的增加和對(duì)Src蛋白的抑制增強(qiáng),HepG2細(xì)胞增殖抑制率上升。

Src蛋白過(guò)度表達(dá)或活化對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)影響還不是十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用反義寡核苷酸減少Src蛋白表達(dá),能夠抑制HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)的生長(zhǎng)。本研究表明,活化的Src蛋白在肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,抑制Src蛋白磷酸化,能夠抑制HepG2細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。但是,不同的腫瘤,或者同一腫瘤的不同類型,Src蛋白對(duì)細(xì)胞增殖凋亡影響是不同的[8-11]。

Src蛋白作為胞質(zhì)內(nèi)蛋白,其過(guò)表達(dá)與相當(dāng)多腫瘤疾病(乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌等)有關(guān),有研究認(rèn)為其與生長(zhǎng)因子有協(xié)同作用,具有癌基因活性。其可被整合素受體、生長(zhǎng)因子受體等細(xì)胞膜受體激活,從而激活不同的信號(hào)通路,引起細(xì)胞增殖、凋亡多種生理效應(yīng)。Src蛋白家族可對(duì)Fak起調(diào)節(jié)作用,通過(guò)色氨酸同源區(qū)域(SH)連接其他胞內(nèi)蛋白激酶,引起激酶鏈反應(yīng)。整合素受體耦聯(lián)ECM與胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架,ECM與整合素受體的結(jié)合促使整合素β亞基的胞質(zhì)端形成黏著斑,并誘發(fā)Src-Fak復(fù)合體的形成及黏著斑蛋白的磷酸化,激活PI-3K,引起細(xì)胞的黏附、遷移。尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移期,Fak與Src蛋白關(guān)系更加密切[9-12]。

綜上所述,Src蛋白在人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中起重要作用。Src蛋白可以通過(guò)其自身多個(gè)位點(diǎn)同多種蛋白直接作用,影響肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為,提供了針對(duì)Src蛋白靶點(diǎn)對(duì)肝癌進(jìn)行分子靶向治療的理論依據(jù)。僅可以開拓它本身的應(yīng)用領(lǐng)域,還可為設(shè)計(jì)更理想的新藥提供新的獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu),后者可被用為創(chuàng)制新藥的先導(dǎo)化合物,經(jīng)驗(yàn)表明這種做法可以更經(jīng)濟(jì)的篩選發(fā)現(xiàn)新藥。在抑制腫瘤的同時(shí),有研究認(rèn)為該藥物還具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)姜黃素同時(shí)可以在體外有效逆轉(zhuǎn)某些實(shí)體瘤(乳腺腺癌 MCF-7/ADR)和白血病(急性早幼粒細(xì)胞白血病HL60/ADR)細(xì)胞系的多藥耐藥,姜黃素組和阿霉素組的敏感性分別比對(duì)照組增加3.39倍和4.18倍。根據(jù)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果,其逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)可能為M RP基因,同時(shí)細(xì)胞系的凋亡也可能通過(guò)Bcl-2蛋白途經(jīng)得到了加強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制很多,但一般認(rèn)為藥泵是其主要并且是最易進(jìn)行逆轉(zhuǎn)的途徑;Mdr1以及MRP基因的編碼產(chǎn)物為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)外排泵作用使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降導(dǎo)致耐藥[9-10],通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MRP基因在兩種耐藥細(xì)胞系中表達(dá)均有所下調(diào),而流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入姜黃素后的細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯高于單獨(dú)使用阿霉素的試驗(yàn)組,說(shuō)明姜黃素可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的藥泵功能使藥物有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部達(dá)到治療的結(jié)果。同時(shí)其抑制效應(yīng)不但作用于實(shí)體瘤細(xì)胞而且作用于白血病細(xì)胞系,提示姜黃素的作用不僅僅是針對(duì)某一類腫瘤(實(shí)體和血液病),其具有較好的廣譜逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)顯示,姜黃素對(duì)耐藥細(xì)胞系有明顯的促凋亡作用,并對(duì)Bcl-2蛋白的表達(dá)有所抑制。姜黃素能否在體內(nèi)試驗(yàn)中同樣逆轉(zhuǎn)多藥耐藥,以及是否通過(guò)促進(jìn)凋亡以及抑制藥泵在體內(nèi)起到逆轉(zhuǎn)耐藥作用還需進(jìn)一步研究。

[1]譚耀紅,楊純正.乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)腫瘤標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤分冊(cè),2002,29(3):206.

[2]Carmixhael J,DeGraff WG,Gazadar AF,et al.Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay:assessment of chemosensitivity testing[J].Cancer Res,1987,47(4):936.

[3]劉寶,薛妍,慕利梅.姜黃素和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC 7721抑制作用的研究[J].腫瘤研究與臨床,2000,12:372.

[4]李光耀,譚耀紅,楊純正,等.白血病患者可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白基因的表達(dá)及其臨床意義[J].中華血液學(xué)雜志,2002,23:293.

[5]Tan YH,Li GY,Zhao CH,et al.Expression of sorcin predicts poor outcome in acute myeloid leukemia[J].Leuk Res,2003,27(2):125.

[6]林溪,許建華,柯丹如.姜黃素與阿霉素聯(lián)合用藥的體外抗腫瘤作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2000,16:522.

[7]楊家榮,楊慧,潘鐵軍.姜黃素對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞組織蛋白酶 D表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(14):1540.

[8]陳忠,章詠裳,李家貴,等.人膀胱癌細(xì)胞耐藥株多基因蛋白表達(dá)的意義[J].中華泌尿外科雜志,1998,19(12):707.

[9]Schuetz EG,Schinkel AH.Drug disposition as determined by the interplay between drugtransporting and drug-metabolizing systems[J].J Biochem Mol Toxicol,1999,13:219.

[10]吳曉健,吳凱南,董蒲江.姜黃素誘導(dǎo)人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞凋亡的研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2005,34(12):1768.