張從紀,楊彥春,單佑安

(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院口腔科,重慶400038)

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向其他細胞分化的巨大潛能。多種生物組織工程和創(chuàng)傷修復(fù)研究結(jié)果充分展示了MSCs作為種子細胞在創(chuàng)傷愈合過程中的潛在應(yīng)用前景[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是主要的促進創(chuàng)傷愈合的因子[2],本研究將VEGF DNA轉(zhuǎn)染到MSCs中,增強其在MSCs中的表達,進一步促使MSCs分化為成熟血管內(nèi)皮細胞以加速創(chuàng)傷愈合過程,為創(chuàng)傷的救治提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑pcDNA3.0-VEGF165質(zhì)粒、攜帶GFP標記基因的pTrack-CM V轉(zhuǎn)移載體、pAdEasy-1腺病毒載體、菌株DH5α由單佑安博士惠贈。主要試劑:PacⅠ、PmeⅠ 、BgⅢ 、SaⅡ 、XhoⅠ 、EcroⅤ(Takara公司),T4 DNA 連接酶、Taq DNA聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)有限公司),Lipofectamine Reagent(Invitrogen公司),ELISA檢測試劑盒(晶美公司),MM LV反轉(zhuǎn)錄酶,λ-HindⅢ digest DNA marker(MBI公司),RNA抽提試劑盒(上海Sangon公司)等。

1.2 MSCs的分離與純化 無菌條件下采集骨髓3mL,用1∶50肝素抗凝,加入等量PBS液洗滌離心(1 000×g離心5min),棄上清液。加入PBS液4mL制備細胞懸液,緩慢加入等量的Percoll分離液(1.073g/L)1 800×g離心20min,收集白膜層的單個核細胞,用PBS液洗滌(1 000×g離心5min)2次,棄上清液,重新懸于含有10%PBS的DM EM/F12培養(yǎng)液中,按105～106/mL的密度接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。24h內(nèi)首次全量換液,其后每3～4天半量換液,至細胞匯合成單層后進行胰酶消化傳代,選取第3代細胞進行鑒定,鑒定選用CD29、CD34、CD44、CD45。

1.3 VEGF基因腺病毒表達載體的構(gòu)建

1.3.1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTrack-CMV-VEGF165的構(gòu)建 根據(jù)VEGF165序列設(shè)計合成上下游引物,VEGF正義鏈5′-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3′, 反 義 鏈 5′-AATGCTT TCTCCGCTCTG-3′,長度為487bp。以本科室原有的經(jīng)測序正確的pcDNA3.0-VEGF165質(zhì)粒為模板,用上述引物進行PCR擴增,獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。將純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pTrack-CMV分別經(jīng) XhoⅠ、EcroⅤ雙酶切后,用膠回收試劑盒回收目的片段,用T4 DNA連接酶連接過夜,氯化鈣法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌,挑取后單克隆,PCR擴增,雙酶切后測序鑒定。

1.3.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建 將測序正確的pTrack-CM V-VEGF165基因重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒用PmeⅠ單酶切線性化,膠回收與pAdEasy-1腺病毒載體用氯化鈣法共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài),酶切后鑒定陽性克隆,獲得重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌,大量擴增陽性克隆。

1.3.3 重組腺病毒的包裝及擴增 按質(zhì)粒抽提試劑盒說明書操作提取重組腺病毒質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒,經(jīng)PacⅠ線性化后,按Lipofectamine Reagent操作說明書轉(zhuǎn)染293細胞,增養(yǎng)3～5d后,在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光,7～10d收集細胞,-70℃、37℃反復(fù)凍融,離心收集上清液,獲取初毒,同法進行大量擴增,氯化銫純化病毒。倍比稀釋法檢測病毒滴度,本實驗的病毒滴度為2.45×1010PFU/mL。

1.4 VEGF轉(zhuǎn)染體外擴增的MSCs

1.4.1 Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染體外擴增的MSCs 取3～6代MSCs按 1×105/孔的密度接種于24孔板中,培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)液,加入用上述培養(yǎng)液作系列稀釋的Ad-VEGF165,1×103(b)、1×105(c)、1×106(d)、1×107(e)、1×108(f)、1×109(g)、1×1010(h)PFU/mL,每個滴度加入 4孔,另設(shè) 4孔作為未加入病毒的空白對照(a),繼續(xù)培養(yǎng)48h,定期觀察轉(zhuǎn)染率。

1.4.2 MSCs增殖的檢測 采用CCK-8法檢測細胞增殖,將MSCs按5×103/200μ L接種 96孔板。分為不同滴度病毒轉(zhuǎn)染組和空白對照組,24h后,每孔加入 10μ L CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)4h,用WellScan MK22型酶標儀450nm波長測定每個孔的吸光度值(A),連續(xù)檢測7d。繪制生長曲線,同時觀察細胞形態(tài)變化。

1.4.3 MSCs中VEGF mRNA含量的檢測[3]采用RT-PCR法,分別于轉(zhuǎn)基因后 24、48、72h 和 5、7、10、14d 按照 RNA 提取試劑盒說明書提取MSCs總RNA,VEGF引物如前所述;內(nèi)參照β-肌動 蛋 白(β-actin)5′端 引物 序 列 為 5′-AAGGTGACCCAGAT-CATGTT TGAG-3′,3′端引物序列為 5′-AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT-3′,DNA 長度為 289bp。采用RT-PCR試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取8μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的普通瓊脂糖凝膠電泳后,用溴化乙啶染色,電泳完畢后在紫外燈下觀察照相,密度掃描分析PCR產(chǎn)物帶。將VEGF與β-actin比值作為 VEGF表達水平的參數(shù),對VEGF PCR產(chǎn)物相對定量。

2 結(jié) 果

2.1 pTrack-CMV-VEGF165重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒及重組腺病毒載體的構(gòu)建 以pcDNA3.0-VEGF165質(zhì)粒為模板進行PCR,能擴增出VEGF165目的片段,重組載體pTrack-CMV-VEGF165 PCR擴增后,經(jīng)XhoⅠ、EcroⅤ雙酶切后同樣能釋放出 487bp大小的片段,表明VEGF165的基因已成功亞克隆于pTrack-CM V轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中(圖1)。DNA序列測定進一步證實成功構(gòu)建了pTrack-CMV-VEGF165重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒?；騐EGF165成功克隆至腺病毒穿梭載體pTrack-CMV中,pTrack-CMVVEGF165重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與骨架DNA在細菌BJ5183中成功重組出腺病毒pAd-VEGF165,重組的腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切后出現(xiàn)一大一小2個片段,大片段約23kb,小片段約4.0kb,與預(yù)期的譜形相同,證實重組腺病毒成功(圖2)。

圖1 pTrack-CMV-VEGF165重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒鑒定電泳圖

2.2 分離、培養(yǎng)MSCs細胞 骨髓細胞培養(yǎng)4h貼壁,形態(tài)均一,呈長梭形,貼壁細胞增殖迅速,10～14d后接近融合呈成纖維狀形態(tài)(圖3)。表面標志CD34、CD35陰性表達,而 CD29、CD44陽性表達,說明所培養(yǎng)的細胞非造血干細胞。

圖2 重組腺病毒pAd-VEGF165經(jīng)PacⅠ酶切電泳圖

圖3 第3代MSCs形態(tài)(倒置相差顯微鏡,×20)

2.3 轉(zhuǎn)染VEGF165后MSCs增殖及形態(tài)變化 MSCs轉(zhuǎn)染pAd-VEGF165后每天在熒光顯微鏡下觀察各滴度的熒光表達,激發(fā)波長為488nm、發(fā)射波長為507nm,轉(zhuǎn)染率=暗視野所見發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)/明視野所見細胞數(shù)。轉(zhuǎn)染后24h可見熒光,7d時熒光表達最強,其不同病毒滴度的轉(zhuǎn)染率:1×103PFU/mL為0、1×105PFU/mL為12%、1×106PFU/mL為34%、1×107PFU/mL為56%、1×108PFU/mL為 78%、1×109PFU/mL為85%、1×1010PFU/mL為85%。

腺病毒載體轉(zhuǎn)染后MSCs細胞仍貼壁生長,呈梭形或多角形,有分裂增殖,但速度有所降低。熒光顯微鏡下,24h可見細胞有綠色熒光表達,但強度較低,48h可見細胞有強烈熒光表現(xiàn),呈全細胞分布,7d熒光表達最強。CCK-8結(jié)果提示:a、b、c 3個組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),其余組與a組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),說明病毒滴度在105PFU/mL以下時,對細胞活力無明顯影響,滴度大于106PFU/mL時,開始對細胞增殖產(chǎn)生抑制,而且隨劑量增加,抑制作用越明顯,從細胞生長曲線還可以看出,4d后病毒對d、e、f、g組細胞增殖能力的抑制漸弱,而 h組細胞8d時抑制作用仍明顯(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)VEGF基因后MSCs中VEGF的水平變化 提取標本總RNA,經(jīng)紫外分光光度計檢測A260/A280值為1.8～2.0,證明無蛋白質(zhì)污染。提取RNA總濃度為0.5～2.0g/L。由于β-actin幾乎存在于所有細胞中,并且含量相對穩(wěn)定,VEGF的基因表達程度以VEGF mRNA相對于β-actin mRNA取得。由圖5可見,轉(zhuǎn)基因后于48～72h達到表達高峰。

圖4 各組細胞的生長曲線

圖5 不同時間段MSCs中VEGF mRNA/β-actin mRNA值變化情況

3 討 論

MSCs具有向其他細胞分化的巨大潛能,近年來其分化潛能不斷被發(fā)現(xiàn),已徹底打破了固有的認識。中胚層起源的MSCs不但可分化為骨骼、肌肉等中胚層組織,也可以跨胚層分化為外胚層的神經(jīng)元和上皮組織,還可分化為內(nèi)胚層的心肌細胞、肝細胞和腎小管上皮細胞[3-5]。在創(chuàng)傷條件下,MSCs能分化成血管內(nèi)皮細胞及表皮細胞參與創(chuàng)傷的修復(fù)過程,因此在生物組織工程和創(chuàng)傷修復(fù)的研究中MSCs占據(jù)了重要位置?？梢栽O(shè)想,如果能調(diào)控MSCs轉(zhuǎn)化為血管母細胞,繼而分化為成熟血管內(nèi)皮細胞,將有效地加速創(chuàng)傷的愈合過程,為創(chuàng)傷的救治提供新的方法。

機體損傷后出現(xiàn)協(xié)調(diào)的愈合過程,其中包括多種細胞、細胞因子和細胞外基質(zhì)之間錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用。細胞因子在創(chuàng)傷愈合過程中具有重要作用,它能調(diào)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)過程中的多種細胞反應(yīng),影響細胞增殖、遷移、細胞外基質(zhì)合成和釋放等[6-7]。在眾多細胞因子中,VEGF在血管的再生過程中起著重要的作用,無論是在傷前組織還是傷后不同修復(fù)階段的組織中,VEGF均呈持續(xù)性陽性表達,它通過促進血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂、血管通透性的增加以及協(xié)助釋放其他生長因子等方式促進局部血管的再生,被公認為首選的促血管生長因子[8-10]。

本實驗使用構(gòu)建的帶有VEGF165的重組腺病毒感染培養(yǎng)的MSCs,滴度為1×107PFU/mL時可獲得56%的感染率,且轉(zhuǎn)染率隨病毒滴度的增加而有所增加,1×109PFU/mL是轉(zhuǎn)染的最佳滴度,超過此滴度不能提高其轉(zhuǎn)染率,并且對細胞的毒性作用明顯。對轉(zhuǎn)染細胞增殖活性的生長曲線分析說明,滴度在1×105PFU/mL以下對細胞增殖無明顯影響,隨著滴度增加,對細胞的增殖有所影響,主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)染病毒的早期,持續(xù)約4d左右,之后細胞的增殖能力漸恢復(fù)。病毒滴度在1×1010PFU/mL時,對細胞的增殖影響最為明顯。表明病毒滴度在1×106～1×109PFU/mL時,可以高效轉(zhuǎn)染,并對細胞增殖影響較小,對后續(xù)研究無明顯影響。

本實驗結(jié)果顯示,MSCs在轉(zhuǎn)染VEGF之后24h即檢測到基因表達,至72h達表達高峰,之后逐漸下調(diào)并維持2周左右時間。說明外源性的VEGF已成功轉(zhuǎn)染到目的細胞體內(nèi),并得以正常表達。雖然其表達為2周左右時間,但在促進創(chuàng)傷愈合方面可能會起到促進作用,因一般創(chuàng)面愈合時間為1周左右。

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