黃 敏,陳顯久,王 彥,楊 靜

脂聯(lián)素是近年來發(fā)現(xiàn)由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì),其具有增加胰島素敏感性[1]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[2]、抗炎癥[3]、防治肝纖維化[4]、抑制腫瘤生長[5]和影響骨代謝[6]等重要生物學(xué)作用。脂聯(lián)素蛋白全長247個(gè)氨基酸,包含有N端信號(hào)序列、可變區(qū)、膠原樣區(qū)和 C端球狀結(jié)構(gòu)域(globular adiponectin,gAd)4個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域[7]。關(guān)于gAd的研究證實(shí)其具有抗糖尿病[8]、促進(jìn)游離脂肪酸氧化[9]和抗動(dòng)脈粥樣硬化[10]等生理學(xué)作用,因此其生物制劑在治療2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)等方面有著良好的應(yīng)用前景。本研究利用基因工程技術(shù)建立gAd的真核表達(dá)載體pcDNA3.0-gAd,為進(jìn)一步研究gAd的生物學(xué)活性,探討其在T2DM治療中的作用效果奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 真核表達(dá)載體pcDNA3.0由解放軍軍事科學(xué)院生物化學(xué)教研室保存提供。菌株E.coli JM109由山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室提供。

1.1.2 主要試劑和酶 基因組 DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker,λ-Hind Ⅲ DNA digest,Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I,DNA凝膠回收試劑盒,DNA片段連接試劑盒,PCR片段純化試劑盒,質(zhì)粒提取試劑盒均購自Takara公司。

1.1.3 設(shè)計(jì)和合成引物 根據(jù)基因庫中報(bào)道的脂聯(lián)素的基因序列(GenBank:EU420013.1),用DNAman軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增 gAd引物引物合成和序列測(cè)定由Takara公司完成。

1.2 方法

1.2.1 健康人全血基因組DNA的提取 健康人全血 由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科提供。取健康人全血 200 μ L,使用基因組 DNA提取試劑盒,獲取約 1 μ g的基因組 DNA,取1 μ L進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 利用PCR擴(kuò)增gAd基因片段 gAd引物由寶生物公司合成并純化。

1.2.3 目的片段回收、雙酶切和純化 使用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收約0.4Kbp的DNA片段,酶切反應(yīng)體系為回收片段(150 ng/μ L)5μL,10×H Buffer 5 μ L,EcoRⅠ(10 U/μ L)1.5 μ L,XhoⅠ(10U/μ L)1.5 μ L,滅菌去離子水 37 μL,共 50 μ L 。37℃反應(yīng)4 h后使用PCR片段純化試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.4 載體的雙酶切和回收 pcDNA3.0載體酶切反應(yīng)體系為 pcDNA 3.0(200ng/μ L)5μ L,10 ×H Buffer5μ L,EcoR Ⅰ(10U/μ L)1.5 μ L,XhoⅠ(10U/μ L)1.5 μ L,滅菌去離子水 37 μ L,共50 μ L。37℃反應(yīng)16 h,取5μ L進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,使用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收約5.4Kbp的DNA片段。

1.2.5 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和篩選陽性克隆 采用熱轉(zhuǎn)化的方法,將基因重組子pcDNA3.0-gAd熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM109,涂布平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑取8個(gè)單菌落,用載體測(cè)序引物5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'和5'-TAGAAGGCA CAGTCGAGG-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增重組 gAd基因片段,取 5 μ L PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA的提取 從健康人全血中提取基因組DNA,得到基因組 DNA片段。詳見圖 1。經(jīng)定量分析其純度A2601A280＞1.8,可用于 PCR擴(kuò)增獲得 gAd基因片段。

圖1 人基因組DNA電泳結(jié)果

3.2 PCR擴(kuò)增gAd基因 以提取獲得的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出的gAd基因片段位于250bp與500bp之間,與預(yù)期的gAd基因片段414bp大小基本相符。詳見圖2。

圖2 PCR法獲取gAd基因片段結(jié)果

3.3 酶切載體 pcDNA3.0 pcDNA3.0經(jīng) EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,回收,獲得的線性DNA大片段位于4361bp與6557bp之間,與載體酶切后約5.4kbp的大小大致相符。詳見圖3。

圖3 酶切pcDNA3.0載體結(jié)果

3.4 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后PCR法篩選陽性克隆 菌落 1、2、5-8的gAp基因克隆片段均位于500bp與750bp之間,其大小與gAd片段的525bp基本相符,初步可判定為陽性克隆。詳見圖4。

圖4 PCR法檢測(cè)克隆片段電泳圖

3.5 測(cè)序鑒定重組體 將3.4的PCR產(chǎn)物1進(jìn)行DNA序列測(cè)定,結(jié)果顯示,該克隆獲得的重組體中g(shù)Ad序列與基因庫中報(bào)道的脂聯(lián)素基因序列(GenBank:EU420013.1)中g(shù)Ad序列完全一致,說明成功構(gòu)建了pcDNA3.0-gAd,且序列正確。

3 討 論

脂聯(lián)素在人的血漿中含量豐富,約占到總血漿蛋白的0.01%[11]。gAd僅含有全長型脂聯(lián)素的球狀功能域,在血液中可檢測(cè)到gAd[12]。人體內(nèi)存在兩種脂聯(lián)素受體,分別為脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(AdipoR2),AdipoR1在骨骼肌細(xì)胞中有豐富的表達(dá),AdipoR2主要在肝臟中表達(dá),AdipoR1對(duì)gAd有更高親和力[13]。gAd還能夠減少由氧化低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的超氧化合物的產(chǎn)生,減少內(nèi)皮細(xì)胞的增殖反應(yīng),增強(qiáng)NO的產(chǎn)生而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。此外,在對(duì)脂聯(lián)素及gAd與各種不同腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究中,許多研究結(jié)果都證實(shí)循環(huán)系統(tǒng)的脂聯(lián)素及gAd的濃度與肥胖和胰島素抵抗相關(guān)的惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[14-16]。

現(xiàn)階段研究所用的gAd片段多是原核生物基因工程來源產(chǎn)品,在蛋白空間結(jié)構(gòu)與天然狀態(tài)的gAd片段存在一定差異,故其活性較低。真核表達(dá)載體表達(dá)的gAd活性較高,擁有原核表達(dá)載體無法實(shí)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0是真核基因工程技術(shù)中使用效率較高的連接、表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.0-gAd,為進(jìn)一步從分子水平探究gAd基因和蛋白質(zhì)的功能、深入探討其生物作用機(jī)制創(chuàng)造了條件。

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