婁利霞,王碩仁,張冬梅,高永紅,孫逸坤

心肌供血不足能夠造成心肌損傷,產(chǎn)生心肌細(xì)胞功能障礙,甚至壞死。心肌缺血時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生代謝的改變,以及心肌細(xì)胞內(nèi)離子平衡紊亂等。缺血心肌還會(huì)發(fā)生功能和結(jié)構(gòu)的變化。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的變化及其炎癥反應(yīng)參與了心肌缺血時(shí)損傷或適應(yīng)性的改變,如缺血后微循環(huán)障礙、血管新生的發(fā)生等[1]。但是現(xiàn)在內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的機(jī)制不清楚。炎癥反應(yīng)是慢性心肌缺血的病理?yè)p傷的重要機(jī)制,可以刺激免疫細(xì)胞,調(diào)節(jié)神經(jīng)體液因素參與缺血性損傷[2]。

前期的基因芯片研究工作提示,炎癥因子細(xì)胞間黏附分子-2(ICAM-2)在缺血心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用研究中被證實(shí)表達(dá)上調(diào)。因此,本實(shí)驗(yàn)研究缺氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-2表達(dá)的影響及其分子機(jī)制,闡明缺氧心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間的分子調(diào)控,有利于從旁分泌角度認(rèn)識(shí)心肌缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所贈(zèng),人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC,貨號(hào)C-003-5C)及其培養(yǎng)基M200(貨號(hào)M-200-500)、低血清生長(zhǎng)添加劑LSGS(貨號(hào)S-003-10)購(gòu)自美國(guó)Cascade Biologics公司。DM EM、胎牛血清以及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibeco公司。

細(xì)胞因子 PDGF-AA、AB、BB,腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素(IL)-1β,IL-6,VEGF,FGF-2購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司(NewJersey,USA)。引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成:ICAM-2上游引物:5'-CCGTGGCAA TGAGACTCTGCACTA-3',ICAM-2下游引物:5'-ATGGTTGCTATGGCCGGAAGG-3',GAPDH上游引物:5'-CATCTCTGCCCCCTCTGCTG-3',GAPDH下游引物:5'-CGACGCCTGCTTCACCACCT-3'。oligo(dT)15和M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司(MO,USA),Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物。ICAM-2小鼠單克隆抗體(sc-9987)多克隆兔抗β-actin抗體(sc-1616)購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司(CA,USA)。大鼠PDGF-ABELISA試劑盒(EK0485)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司,大鼠PDGF-BB ELISA試劑盒(3R123c)購(gòu)自美國(guó) RapidBio Lab公司(CA,USA)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2在含有10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 μ g/mL四環(huán)素的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HUVEC在含有100 U/mL青霉素,100 μ g/mL四環(huán)素以及LSGS添加劑的專用培養(yǎng)基M200中培養(yǎng)。HUVEC長(zhǎng)到90%～95%時(shí),轉(zhuǎn)入無(wú)血清和添加劑的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 缺氧培養(yǎng)上清的制備 H9c2細(xì)胞37℃,5%CO2培養(yǎng),長(zhǎng)至80%～90%時(shí)去上清,PBS洗3次,加入無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基,放入氧氣濃度為1%的缺氧培養(yǎng)箱(Mini Galaxy A-500,UK)。缺氧培養(yǎng)24 h后收集上清,用于HUVEC培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn) 取4代或5代的 HUVEC細(xì)胞,長(zhǎng)至90%后更換無(wú)因子添加劑的M200中過(guò)夜培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[3]制備,各細(xì)胞因子的刺激濃度為:PDGF-AA 20 ng/mL,PDGFAB 20 ng/mL,PDGF-BB 20 ng/mL,TNF-α20 ng/mL,IL-1β 5 ng/mL,IL-6 20 ng/mL,VEGF 20 ng/mL,FGF-2 25 ng/mL。

1.5 RNA提取和RT-PCR 加氯仿室溫震蕩3min,4℃12 000 r/min離心15 min,取上清加異丙醇冰上放置5 min后4℃12 000 r/min離心10 min,棄上清加75%乙醇洗沉淀,4℃12 000 r/min離心10 min后棄上清,室溫晾干,加入DEPC處理過(guò)的H2O冰上溶解,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。

取1 μ g總 RNA,在 oligo(dT)15和M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系為25μL∶1μ L cDNA,5 μ mol/L上下游引物各1μL,2.5 mmol/L dNTP混合物 1μ L,1.5 mmol/L MgCl21.5 μ L,10×PCR 緩沖液 2.5 μ L,1.25 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件為:94℃變性5 min,然后進(jìn)行30次擴(kuò)增反應(yīng):94℃30 s,57℃30 s,72℃延伸 40 s,最后72℃延伸10 min。

1.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 處理后細(xì)胞甩掉上清,PBS洗3次,最后吸干所有液體,加裂解緩沖液,冰浴條件下吹打裂解細(xì)胞,或行超聲破碎,4℃ 13 000 r/min離心10 min,取上清進(jìn)行蛋白定量,等體積加入2x蛋白上樣緩沖液,100℃煮沸20 min。將樣本蛋白行SDS-PAGE(10%)電泳,電轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素(NC)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,以含0.05%吐溫的PBS(TBS)洗滌 3次,1∶1 000的 ICAM-2抗體,4℃孵育過(guò)夜,TBS沖洗3遍,加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)的羊抗兔IgG抗體(1∶6 000)。室溫孵育1h,以TBS液沖洗3次,ECL(北京Applygen公司)化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的測(cè)定 每孔加入100μ L樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃反應(yīng)90 min,甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體,不洗。每孔加100 μ L生物素標(biāo)記的抗體,37℃反應(yīng)60 min。0.01 mol/L PBS洗滌3次。每孔加100 μ L親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)工作液,37℃反應(yīng)30 min。0.01 mol/L PBS洗滌5次。每孔加入90 μ L TMB顯色液,37℃避光反應(yīng)6 min～10 min。每孔加入100 μ L TMB終止液,用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定OD值。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞系缺氧培養(yǎng)上清誘導(dǎo)HUVEC的ICAM-2表達(dá) 通過(guò)H9c2心肌細(xì)胞系缺氧培養(yǎng),得到心肌細(xì)胞系缺氧培養(yǎng)上清。在37℃,5%CO2條件下對(duì)HUVEC孵育,不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在mRNA水平,缺氧上清孵育1 h后ICAM-2的表達(dá)明顯升高,孵育 3 h后達(dá)到最高,在 6 h、12 h有所下降(見(jiàn)圖1)。通過(guò)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),缺氧培養(yǎng)上清孵育后,在蛋白水平,HUVEC表達(dá) ICAM-2在 3 h、6 h表達(dá)明顯增高,而在15 h、21 h表達(dá)有所下降,趨于正常對(duì)照(見(jiàn)圖2)。

2.2 細(xì)胞因子在H9c2缺氧培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的ICAM-2表達(dá)中的作用 為了尋找是H9c2缺氧培養(yǎng)上清中含有的哪種細(xì)胞因子刺激了HUVEC細(xì)胞ICAM-2的表達(dá),選擇了多種已知的細(xì)胞因子進(jìn)行了細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn)。在37℃,5%CO2條件下對(duì) HUVEC刺激6 h后,收集細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子 PDGF-BB和 PDGF-AB可以使 HUVEC表達(dá)ICAM-2顯著增加(見(jiàn)圖 3)。因此推測(cè),可能PDGF-BB和PDGF-AB是H9c2缺氧培養(yǎng)上清中能刺激ICAM-2表達(dá)的有效成分。為進(jìn)一步驗(yàn)證事實(shí),我們對(duì)H9c2缺氧培養(yǎng)上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量進(jìn)行了檢測(cè),并與H9c2常氧培養(yǎng)上清相比較。

圖3 HUVEC細(xì)胞在不同細(xì)胞因子刺激6 h后ICAM-2的蛋白表達(dá)

2.3 H9c2的缺氧培養(yǎng)上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量(見(jiàn)表1)ELISA方法檢測(cè)H9c2的缺氧培養(yǎng)上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常氧上清中的含量相比,在缺氧上清中PDGF-BB有顯著性增加(P＜0.05),而缺氧上清中的PDGF-AB卻有顯著減少(P＜0.01)。在缺氧培養(yǎng)時(shí)PDGF-BB的分泌為(64.1±7.6)pg/104細(xì)胞,較常氧培養(yǎng)時(shí)PDGF-BB的分泌量(55.7±4.7 pg/104)細(xì)胞增加15%。這個(gè)結(jié)果表明,缺氧條件下PDGF-BB的分泌量的增加,可能是缺氧上清誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞表達(dá)ICAM-2的原因。

表1 H9c2的常氧培養(yǎng)上清和缺氧培養(yǎng)上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量(±s)pg/104細(xì)胞

表1 H9c2的常氧培養(yǎng)上清和缺氧培養(yǎng)上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量(±s)pg/104細(xì)胞

項(xiàng)目 n 常氧 缺氧PDGF-BB 6 55.7±4.7 64.1±7.61)PDGF-AB 6 66.9±10.3 46.9±7.72)與常氧上清比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

3 討 論

心肌細(xì)胞的缺氧可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷甚至凋亡,是冠心病、心肌梗死發(fā)生的重要病理環(huán)節(jié)。缺氧發(fā)生后,常會(huì)在缺血組織發(fā)生炎癥反應(yīng)以及小血管數(shù)目的增加。其中的機(jī)制涉及心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用。但是迄今為止,它們之間的相互作用還不是很清楚。

本研究發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞系H9c2的缺氧培養(yǎng)上清可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC表達(dá)ICAM-2。通過(guò)細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn)以及測(cè)定兩種因子的含量發(fā)現(xiàn),PDGF-BB和PDGF-AB可以刺激HUVEC表達(dá)ICAM-2,同時(shí)PDGF-BB在缺氧上清中較正常培養(yǎng)上清中增高,而 PDGF-AB相反。上述結(jié)果提示,H9c2在缺氧條件下產(chǎn)生的因子PDGF-BB是其中起作用的物質(zhì)。

ICAM-2在內(nèi)皮細(xì)胞和血小板高表達(dá),最初是以白細(xì)胞整合素、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)的反受體被克隆發(fā)現(xiàn)的。同時(shí)它也是樹(shù)突細(xì)胞特異ICAM結(jié)合非整合素蛋白(DC-SIGN)的反受體[4]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn) ICAM-2在血管發(fā)生中有重要作用。在內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-2的表達(dá)能被細(xì)胞間接觸和生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié),體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明ICAM-2的缺失導(dǎo)致血管生成減少,ICAM-2集中分布在細(xì)胞間連接處,通過(guò)同分子相互作用參與內(nèi)皮形成管狀結(jié)構(gòu)和血管生成。同時(shí),ICAM-2通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生,調(diào)節(jié)Rac活化,促進(jìn)血管生成[5]。但是,在心肌梗死后的血管生成中內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-2是如何受到細(xì)胞間相互作用調(diào)節(jié)的尚不清楚。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn) TNF-α和IL-1β可以在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)ICAM-2的表達(dá)[6]。在人虹膜微血管內(nèi)皮,內(nèi)皮素和TNF-α刺激下可以被緩慢下調(diào)ICAM-2的表達(dá)[7]。本研究結(jié)果提示,缺氧心肌細(xì)胞產(chǎn)生的PDGF-BB可能刺激ICAM-2的表達(dá)。

PDGF-BB是血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)的一種亞型。PDGF有同源雙聚體(PDGF-AA,PDGF-BB)和異源雙聚體(PDGF-AB)等三種亞型,其中PDGF-BB促新生血管化的作用最強(qiáng)[8]。PDGF-BB及其受體在微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移,有利于血管發(fā)生。PDGF不僅作用于內(nèi)皮細(xì)胞,也可作用于管壁其他細(xì)胞,如間質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分化和分裂,從而形成完整的血管[9]。本研究提示,PDGF-BB可以介導(dǎo)缺氧心肌和內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用,使內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-2的表達(dá)增加。而ICAM-2的表達(dá)被證實(shí)在血管發(fā)生中有重要作用[5]。因此,缺氧心肌通過(guò)PDGF-BB誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-2的表達(dá),從而促進(jìn)血管發(fā)生可能是缺血區(qū)域的血管新生發(fā)生的重要機(jī)制。但是,其中的作用通路還需要進(jìn)一步研究證實(shí),其中的信號(hào)通路調(diào)節(jié)還需要深入的研究。

(致謝:美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管科血管生成研究中心李建教授)

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