王建湘,程丑夫,鄧滿霞

許多研究表明,炎癥反應參與了心肌缺血再灌注損傷(my- ocardial ischemia reperfusion injury,MIRI),其中中性粒細胞(PM N)浸潤是介導該炎癥反應的主要媒介[1]。在再灌注早期(即＜1 h),大多PMN黏附于血管內(nèi)皮細胞并引起內(nèi)皮損傷,間接導致心肌損傷;隨著再灌注時間的延長,更多PMN移動到血管外并黏附在心肌細胞上,參與心肌細胞損傷。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)在內(nèi)皮及心肌細胞中的誘生對PMN介導的缺血再灌注損傷至關重要[2]。ICAM-1通過誘導PMN黏附在內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮下基質(zhì)并穿過內(nèi)皮遷移流入缺血區(qū),通過阻塞微血管、釋放氧自由基等機制導致心肌細胞損傷,使梗死過程加劇。舒冠滴丸具有芳香通脈、益氣溫陽、豁痰化瘀功效,前期研究證實[3,4],舒冠滴丸能抑制內(nèi)皮細胞ICAM-1mRNA異常表達,對高脂血清損傷的內(nèi)皮細胞具有保護作用;具有調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂,減少動脈內(nèi)膜斑塊數(shù)量,消退和穩(wěn)定動脈粥樣硬化(AS)斑塊,降低血漿sCD40L、可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1)水平,其作用可能與抑制AS斑塊炎癥反應有關。本研究擬建立高脂血癥大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,觀察舒冠滴丸對缺血再灌注損傷心肌ICAM-1表達的影響,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠,體重 180 g～200 g,由湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心提供,醫(yī)學實驗動物合格證號:醫(yī)動字第20-007號,于清潔級飼養(yǎng)室適應性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 藥品與試劑、儀器 舒冠滴丸由冰片、鵝不食草、丁香、肉桂、紅參、白芥子、三七等中藥制成滴丸,每粒 50 mg,由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供,批號:20061128,用 2×DMEM/F12稀釋成20 mg/mL,抽濾滅菌,4℃保存?zhèn)溆?辛伐他汀片,每片20 mg,由杭州默沙東制藥有限公司提供,批號:20080321;膽固醇、膽酸鈉(武漢亞法生物技術有限公司);甲基硫氧嘧啶(上海復星朝暉藥業(yè)有限公司);丙二醇(上海生物工程有限公司);小鼠抗人-ICAM-1單克隆抗體(Zymed公司,USA);SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物科技股份有限公司);總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(北京中生生物工程高技術公司);高速冷凍離心機(Beckman Allerga 25R);光學顯微鏡(江蘇凈化設備廠);CL-7200全自動生化分析儀(日本島津公司);HX-200動物呼吸機(成都太盟科技有限公司);Image-Pro Plus 4.5圖像分析系統(tǒng)(Olympus公司,Japan)。

1.3 大鼠高脂血癥模型的建立 根據(jù)文獻[5]的方法,健康雄性Wistar大鼠,在基礎飼料喂養(yǎng)的基礎上,予配制的脂肪乳高脂飲食10 mL/(kg?d)連續(xù)灌胃14 d即可造成高脂血癥模型。

1.4 實驗分組及處理 Wistar大鼠70只,隨機分成7組,每組10只?？瞻讓φ战M:常規(guī)飼養(yǎng),不做任何處理;模型組:每天給予生理鹽水10 mL/kg灌胃;假手術組:手術措施同模型組,只穿線不結(jié)扎冠狀動脈,每天給予生理鹽水10 mL/kg灌胃;舒冠滴丸高劑量組:手術措施同模型組,每天給予舒冠滴丸250 mg/kg灌胃;舒冠滴丸中劑量組:手術措施同模型組,每天給予舒冠滴丸125 mg/kg灌胃;舒冠滴丸低劑量組:手術措施同模型組,每天給予舒冠滴丸50 mg/kg灌胃;陽性藥物對照組:手術措施同模型組,每天給予辛伐他汀5 mg/kg灌胃。高脂血癥大鼠不同處理因素持續(xù)灌胃14 d,末次給藥后1 h用于實驗。

1.5 在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立 按文獻[6]方法,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)麻醉。麻醉后仰臥位固定四肢及頭部于手術臺上,連接心電電極記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。行頸部正中切口分離氣管,穿線備用,氣管插管,連接小動物呼吸機(室內(nèi)空氣,潮氣量2 mL/100 g,呼吸頻率60/min)。于心尖搏動處縱行分離皮膚、肌層,剪斷2肋～4肋,分離心包膜,輕輕擠壓胸廓,暴露心臟,掀起左心耳,于左心耳根部下方肺動脈圓錐旁以5/0帶彎針尼龍縫線迅速穿過冠脈下方,將心臟放回胸腔。穩(wěn)定10 min后,提拉穿過小塑料管的縫線兩端,將塑料管壓向心肌表面,用止血鉗夾住小管及其中縫線以結(jié)扎冠脈造成心肌缺血,45 min后松開止血鉗以形成再灌流,120 min再灌注后結(jié)束實驗。模型復制成功的標準:結(jié)扎后Ⅱ?qū)?lián)心電圖以J點或ST段明顯抬高或QRS波增高、增寬與T波融合,呈弓背向上單向曲線為心肌缺血成功復制;放松結(jié)扎線后,抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功復制。

1.6 心肌組織HE染色 實驗結(jié)束后,將大鼠立即處死取心,切取左心室于10%甲醛中常規(guī)固定,流水沖洗,經(jīng)各級乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,HE染色,中性樹膠封片,于光鏡下觀察。

1.7 心肌組織ICAM-1免疫組化測定 取心肌組織標本常規(guī)脫蠟至水,免疫組化染色采用S-P法,利用小鼠抗人ICAM-1單克隆抗體嚴格按文獻[7]報道方法和試劑盒說明書進行心肌組織ICAM-1免疫組化測定,DAB顯色劑顯色,蘇木素輕度復染,中性樹膠封片。實驗以PBS代替一抗進行反應作陰性對照。通過ALTA U2圖像采集卡采集圖像,Image Pro Plus 4.5圖像分析系統(tǒng)進行計算機圖像分析,統(tǒng)一參數(shù)設定保持基線一致,其陽性追蹤點為表達于胞漿或胞膜的棕黃色定位。每張切片隨機觀察10個視野,計算切片各視野陽性點面積總和及光密度均值,以陽性點面積總和/陽性點光密度均值表示陽性表達強度。

1.8 血脂檢測 實驗結(jié)束前心臟取血2 mL,3 000 r/min離心15 min后取上清,-20℃保存,標本收集結(jié)束后由CL-7200全自動生化分析儀測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,各組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組缺血再灌注損傷大鼠心肌病理形態(tài)學變化 光鏡下見模型組心肌纖維排列紊亂,呈波浪狀,部分區(qū)域有斷裂,胞漿嗜酸性增強,可見空泡樣變,心肌間質(zhì)嚴重水腫,有少量炎性細胞;辛伐他汀組心肌纖維排列基本整齊,空泡變性減輕,心肌間質(zhì)輕度水腫;舒冠滴丸組心肌細胞排列基本整齊,心肌纖維排列基本整齊,空泡變性減輕,心肌間質(zhì)水腫不明顯,炎細胞浸潤減少。辛伐他汀組病理改變與舒冠滴丸高劑量組相近。

2.2 各組大鼠心肌組織ICAM-1蛋白表達變化 模型組心肌組織ICAM-1蛋白表達顯著高于假手術組(P＜0.01),說明MIRI使ICAM-1表達增強。與模型組比較,舒冠滴丸各劑量組ICAM-1蛋白表達量均降低(P＜0.05)。辛伐他汀組心肌ICAM-1蛋白表達量與舒冠滴丸高劑量組相近,空白組和假手術組比較,大鼠心肌ICAM-1蛋白表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組ICAM-1表達變化的比較(±s)

表1 各組ICAM-1表達變化的比較(±s)

組別 n ICAM-1空白組 10 103.35±155.72假手術組 10 105.47±156.45模型組 10 352.41±215.291)舒冠滴丸高劑量組 10 172.43±154.722)舒冠滴丸中劑量組 10 173.35±160.912)舒冠滴丸低劑量組 10 175.48±156.352)辛伐他汀組 10 175.21±156.832)與假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05

2.3 各組大鼠血脂含量變化 與空白組比較,模型組血清TC、TG、LDL-C含量明顯升高(P＜0.01),HDL-C含量明顯下降(P＜0.01),表明大鼠高脂血癥模型復制成功。與模型組比較,舒冠滴丸高劑量和中劑量組可明顯降低血清TC、TG、LDL-C(P＜0.05),升高HDL-C(P＜0.05),舒冠滴丸低劑量組和模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);辛伐他汀組血脂與舒冠滴丸高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);假手術組和模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 舒冠滴丸對MIRI大鼠血脂含量的影響(±s)mmol/L

表2 舒冠滴丸對MIRI大鼠血脂含量的影響(±s)mmol/L

組別 n TC TG HDL-C LDL-C空白組 10 5.29±0.59 0.56±0.03 1.62±0.05 1.05±0.07假手術組 10 11.23±1.05 1.67±0.06 0.86±0.17 1.64±0.02模型組 10 11.29±1.411) 1.69±0.021) 0.87±0.011) 1.63±0.011)舒冠滴丸高劑量組 10 7.91±1.672) 0.96±0.082) 1.28±0.022) 1.15±0.072)舒冠滴丸中劑量組 10 8.43±0.012) 1.08±0.082) 1.19±0.042) 1.24±0.042)舒冠滴丸低劑量組 10 10.27±0.18 1.41±0.05 0.91±0.13 1.45±0.03辛伐他汀組 10 7.74±0.022) 0.81±0.082) 1.33±0.042) 1.09±0.042)與假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05

3 討 論

近年來,中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞的黏附、白細胞的聚集在缺血再灌注損傷發(fā)生中的重要性已被認識,特別是黏附分子的研究已受到廣泛重視。在心肌缺血再灌注期間有大量炎性細胞特別是中性粒細胞在微血管出現(xiàn)聚集乃至堵塞中斷血流,這是由于微血管內(nèi)皮細胞與炎性細胞發(fā)生黏附反應的結(jié)果。ICAM-1又稱CD45,屬于免疫球蛋白超家族的一員,為19號染色體基因編碼的單鏈跨膜糖蛋白,其核心多肽分子量為55 000。它作為白細胞功能相關抗原、巨噬細胞分化抗原-1的配體,參與白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附并向血管外遷移,黏附心肌細胞釋放細胞毒,表達增強的ICAM-1還可反饋作用于內(nèi)皮細胞、巨噬細胞,促進細胞因子等炎癥介質(zhì)的表達。國外研究發(fā)現(xiàn)[8],MIRI中ICAM-1表達明顯升高,且與心肌損傷密切相關。正常情況下,血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞僅表達極少量的ICAM-1,而在缺血再灌注時,ICAM-1可在核轉(zhuǎn)錄因子-κ B(NF-κ B)、活性蛋白-1(AP-1)、白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等作用下表達量成倍增加[9]。ICAM-1的高表達可刺激中性粒細胞與內(nèi)皮細胞黏附,介導其對心肌細胞的浸潤,引起并加劇心肌細胞的損傷,導致細胞死亡。有研究表明[10,11],心肌缺血1 h后再灌注1 h,在缺血心肌中可檢出ICAM-1mRNA,且隨再灌注時間延長而表達增加,而再灌注3 h,非缺血心肌仍無明顯ICAM-1mRNA表達。Niessen等[12]研究認為AMI心肌細胞中ICAM-1高表達,若抑制其表達,可減小梗死面積。而應用ICAM-1特異性抗體可以減少再灌注后的心肌損傷和心肌梗死面積[12]。本研究發(fā)現(xiàn),缺血45 min再灌注2 h后模型組心肌組織ICAM-1蛋白表達顯著高于假手術組(P＜0.01),說明MIRI使ICAM-1表達增強;與模型組比較,舒冠滴丸各劑量組ICAM-1蛋白表達量均降低(P＜0.05),提示其可以降低大鼠MIRI心肌ICAM-1蛋白表達量,減輕PM N浸潤,抑制其炎癥反應。

高脂血癥是冠心病的獨立危險因素之一,是動脈粥樣硬化性疾病的重要病因。本研究通過改變動物的飲食習慣,成功地建立了食源性大鼠高脂血癥模型,并在此基礎上采用結(jié)扎冠脈左前降支的方法,制備成大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,此動物模型的心電圖演變、心肌酶學改變及組織病理形態(tài)學變化均與人類發(fā)生急性心肌梗死接近[13],能高度模擬臨床冠心病的發(fā)生發(fā)展及治療過程,使實驗結(jié)果更具有臨床指導意義。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清 TC、TG、LDL-C的含量均明顯升高,而HDL-C顯著下降,說明模型組大鼠存在著血脂代謝紊亂,通過舒冠滴丸干預治療,結(jié)果顯示可以顯著降低高脂血癥模型大鼠血清 TC、TG、LDL-C的水平,明顯提高血清 HDL-C的水平,表明舒冠滴丸可有效地糾正高脂血癥大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂。

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