郭 來 王再謨

肝纖維化（HF）是一切慢性肝病共同的病理學(xué)特征，也是病情進一步向肝硬化發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。能否將病變終止于HF或逆轉(zhuǎn)至正常，是治療各種慢性肝病的關(guān)鍵，也是影響療效和死亡率的重要因素。近年來的研究提示，HF在進入肝硬化之前，過度沉積的細(xì)胞外間質(zhì)（ECM）是可以逆轉(zhuǎn)的。肝心寧膠囊經(jīng)臨床驗證，對HF及早期肝硬化確有一定的療效，為了進一步探討其作用機理，筆者進行了一系列實驗研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：SD雄性大鼠83只，體質(zhì)量（200g±10）g，一級動物，由四川省抗生素研究所提供，檢驗后備用。（2）試劑：液體雙試劑（上?？茖W(xué)東菱試劑廠提供）；37% ～40%甲醛（重慶東方試劑廠提供，分析純，批號：950938）；CCI4（鄭州化學(xué)試劑二廠提供，分析純，批號：95048）；無水乙醇（安徽特級酒精總廠提供，分析純，批號：950879）。（3）儀器：法國 S-500P 半自動生化分析儀；ACE919型全自動生化分析儀（日本尼泰克公司生產(chǎn)）；721型分光光度計（四川分析儀器廠生產(chǎn)）；電子天平（上海第二天平儀器廠生產(chǎn)）；LZT1臺式電動離心機；JEM-100SX電鏡（日本電子公司）。（4）藥劑：秋水仙堿（匈牙利Laboratoyes公司產(chǎn)品，批號：95910）用蒸餾水配制成16.7ug/mL溶液置4℃冰箱中備用。大黃蜇蟲丸（中國廣東陽江制藥廠產(chǎn)品，批號：961113）用蒸餾水配制成0.2g/mL懸濁液置4℃冰箱中備用。肝心寧膠囊：由丹參、茵陳、連翹、肉桂、制何首烏、女貞子、五味子等制成半浸膏裝膠囊內(nèi)（廣漢市中醫(yī)藥研究所研制，批號：970304）。將肝心寧流浸膏配成混懸液，其中肝心寧高劑量組質(zhì)量濃度為0.19g/mL；肝心寧低劑量組質(zhì)量濃度為0.095g/mL；分別相當(dāng)于生藥2.5、1.5g/mL。

1.2 方法 （1）分組：將83只大鼠按完全隨機方法分為6組，即正常組8只，模型組、秋水仙堿組、大黃蜇蟲丸組、肝心寧高劑量組、肝心寧低劑量各15只。自由攝食全價顆粒飼料，飲水馴化喂養(yǎng)1周后使用。在實驗過程中均開架分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自然光照，并定期清潔、消毒。（2）動物模型制作：大鼠在實驗室喂養(yǎng)1周后開始實驗。實驗第1日按0.5mL/100g體質(zhì)量皮下注射的40%CCl4橄欖油，以后每隔3d（或4d）按0.3mL/100g體質(zhì)量皮下注射40%CCI4橄欖油，共13次。在整個實驗過程中，正常組大鼠飼以全價飼料，自由飲自來水，其余各組均以飼料配方1（79%純玉米粉+20%豬油+0.5%膽固醇壓制成顆粒飼料）喂養(yǎng)2周，繼之以飼料配方2（89.5%純玉米粉+10%豬油+0.5%膽固醇混合物壓制成顆粒飼料）喂養(yǎng)至6周末，另外以30%乙醇為飲料飼養(yǎng)動物。（3）給藥及取標(biāo)本方法：從實驗第2日開始定時灌胃，每日1次，每次給藥劑量為：肝心寧高劑量組1mL/100g體質(zhì)量（0.19g/mL，相當(dāng)于臨床用量的20倍）；肝心寧低劑量組1mL/100g體質(zhì)量（0.095g/mL，相當(dāng)于臨床用量的10倍）；秋水仙堿組1mL/100g體質(zhì)量（16.79/mL，相當(dāng)于臨床用量的10倍）；大黃蜇蟲丸組1mL/100g體質(zhì)量（0.2g/mL相當(dāng)于臨床用量的10倍）；正常組、模型組給予1mL/100g體質(zhì)量蒸餾水，灌胃前先將藥液靜置到室溫，搖勻，再根據(jù)不同體重給藥，共給藥42d，末次給藥24h后行乙醚麻醉，剖腹，取肝臟待測。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 （1）光鏡：試驗結(jié)束時，取肝臟左葉標(biāo)本以10%甲醛固定，石蠟包埋，梯度脫水，常規(guī)脫蠟，切片，HE染色作光鏡檢查。（2）電鏡：取0.1cm3肝組織標(biāo)本經(jīng)3%戊二醛及1%鋨酸雙固定，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重電子染色。使用日本電子公司JEM-100SX型透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡 （1）正常組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，核圓形，含有小葉間動脈、門靜脈和膽小管，無炎細(xì)胞浸潤。（2）模型組：均可檢出不同程度的纖維增生，由匯管區(qū)，小葉間進一步伸入并分割肝小葉。匯管區(qū)、肝竇周圍可見多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，多數(shù)胞質(zhì)內(nèi)有大量脂滴，少數(shù)肝細(xì)胞質(zhì)疏松和腫脹，發(fā)生氣球樣變性。（3）秋水仙堿組：可見較多的炎細(xì)胞浸潤，但纖維組織增生較模型組明顯減輕。（4）大黃蜇蟲丸組：肝細(xì)胞排列較規(guī)整，膠原纖維明顯減輕，無假小葉形成，肝細(xì)胞數(shù)目增多。（5）肝心寧低劑量組：與模型組比較，肝細(xì)胞排列較規(guī)整，偶見肝小葉點狀壞死灶，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤。（6）肝心寧高劑量組：肝小葉間有少量纖維組織增生，個別肝細(xì)胞氣球樣變，匯管區(qū)有少量淋巴細(xì)胞浸潤。

2.2 電鏡 見圖1～圖6。（1）正常組：肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞呈卵圓形，核仁清楚，肝細(xì)胞連接較緊密，細(xì)胞間通道有微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體，細(xì)胞核周圍有分布規(guī)律的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體周圍有高爾基復(fù)合體。（2）模型組：肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，胞間微絨毛消失，肝細(xì)胞之間有膠原纖維增生，核縮小，胞核內(nèi)脂肪滴分布多量，線粒體腫脹。（3）秋山仙堿組：肝細(xì)胞間膠原纖維增生略有好轉(zhuǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布紊亂無規(guī)律，胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少，胞漿內(nèi)溶酶體可見。（4）大黃蜇蟲丸組：核內(nèi)染色體較模型組增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布較規(guī)律，胞漿內(nèi)有少量的脂滴。（5）肝心寧低劑量組：肝細(xì)胞間膠原纖維增生明顯減輕，線粒體腫脹好轉(zhuǎn)，胞漿內(nèi)脂滴明顯減少，糖原顆粒較多。（6）肝心寧高劑量組：肝細(xì)胞形態(tài)大致正常，膠原纖維少見，線粒體數(shù)目增多，高爾基體典型分布規(guī)律，糖原顆粒數(shù)目增多。

3 討論

圖1 正常組（EM×12800）

圖2 模型組（EM×12800）

圖3 秋水仙堿組（EM×12800）

圖4 大黃蜇蟲丸組（EM×12800）

圖5 肝心寧低劑量組（EM×12800）

圖6 肝心寧高劑量組（EM×12800）

肝纖維化是指肝組織內(nèi)ECM成分過度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或功能異常的病理變化[1]。是各種慢性肝病共有的病理特征，也是發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，大量研究表明，肌纖維化有逆轉(zhuǎn)的可能[2]。肌纖維化形成原因主要與病毒在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制和免疫功能失調(diào)有關(guān)。病毒不能及時被清除而不斷感染健康的肝細(xì)胞，并激活免疫機制，使肝細(xì)胞受損范圍不斷擴大，病情進行性加重，使肝內(nèi)有過多的膠原沉積，纖維增生，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞[3]。肝纖維化發(fā)生最常見的原因為慢性病毒性肝炎，其次為與酒精和肥胖相關(guān)的脂肪性肝炎、血吸蟲肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病、新生兒肝病、代謝性肝病等[4]。

肝纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”、“鼓脹”范疇。傳統(tǒng)多認(rèn)為“血瘀”為其基本病機，治療多從活血化瘀入手，但療效并非盡如人意?，F(xiàn)今臨床多認(rèn)為，正虛邪實、虛痰瘀毒是本病的主要特點，肝郁脾虛、痰瘀阻滯是本病的主要病機[5]。

本研究顯示，模型組出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹，不同程度纖維組織增生，并分割肝小葉，同時匯管區(qū)及肝竇周圍有白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，少數(shù)肝細(xì)胞腫脹，發(fā)生氣球樣變。肝心寧低劑量及肝心寧高劑量組上述情況明顯減輕。電鏡觀察，模型組出現(xiàn)線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布不規(guī)律，糖原顆粒減少，膠原纖維大量增生，并分割肝細(xì)胞，胞漿內(nèi)有大量脂滴。肝心寧低劑量及肝心寧高劑量組上述情況明顯減輕。

我們采用復(fù)合因素造模方法，即用CCl4皮下注射，在飼料中混以豬油、膽固醇，并以30%乙醇為飲料。本模型42d左右即可形成，與大多數(shù)肝纖維化相似，具有周期短，死亡率低，模型成功率高等優(yōu)點[6]。

肝心寧膠囊尊崇張仲景《金匱要略》五味治肝的學(xué)術(shù)思想：即“夫肝之病，補用酸，助用焦苦，益用甘味之藥調(diào)之?！贝酥倬案尾∮盟幍奈逦兑?guī)律。本方中酸味藥為五味子，苦味藥丹參、茵陳，甘味藥為制何首烏、女貞子、甘草等。酸能補肝，故補用酸。心為肝之子，子能令母實，故助用焦苦。甘能緩急，又能和中，故以甘味之藥調(diào)之。稍佐肉桂芳香走串，以加強活血化瘀作用，具補虛不傷正、扶正不戀邪、攻補兼施之功效。

本方有良好的保護肝細(xì)胞，清除脂滴，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，保護肝細(xì)胞器，清除氧自由基作用。其機理可能與肝心寧膠囊及其有效成分抑制脂質(zhì)過氧化，減輕脂質(zhì)過氧化對生物膜系統(tǒng)的損傷，減輕氧自由基對細(xì)胞器的損害有關(guān)。

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[5]徐曉琪，李民，曹衛(wèi)菊，等.加味瓜蔞散對肝硬化門靜脈高壓癥患者胃腸激素、肝纖維化指標(biāo)和血流動力學(xué)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2009，19（2）：70 ～ 72.

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