宋妮娜 高 政 孫文芳 姜麗杰

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院北院神經(jīng)內(nèi)科 大連 116031

缺血性腦血管病是人類的常見(jiàn)病、多發(fā)病,致死率與致殘率均很高,嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量。缺血性腦血管病患者發(fā)病時(shí)多伴有血糖的升高,使腦缺血的治療更加復(fù)雜。本研究旨在通過(guò)預(yù)防性應(yīng)用拜阿司匹靈,觀察在高血糖狀態(tài)下,SD大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積,內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)的表達(dá)情況,并探討高血糖狀態(tài)下,拜阿司匹靈預(yù)處理后對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共36只,體質(zhì)量180～220 g,血糖正常(＜6 mmol/L),術(shù)前禁食12 h。按隨機(jī)化原理分為2組:對(duì)照組(n=18)、拜阿司匹靈(n=18),各組按缺血90min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分為3個(gè)亞組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥方法:拜阿司匹靈組大鼠在手術(shù)前3 d灌胃,劑量為6mg/kg。

1.2.2 大鼠高血糖模型制備:在阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)前30min均腹腔注射50%葡萄糖溶液(3 g/kg)。栓線前取鼠尾血一滴,用血糖儀測(cè)定血糖值＞11.1 mmol/L表示模型建立成功。

1.2.3 參照改良的 Longa-Zea氏線栓法[1]:制作大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)閉塞的腦缺血模型。于栓塞90min拔出栓線實(shí)行再灌注,分別于再灌注后 3 h、6 h、24 h(每個(gè)亞組 6只)處死動(dòng)物。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 腦梗死體積的測(cè)定:過(guò)量水合氯醛腹腔注射麻醉致大鼠死亡,迅速斷頭取腦速凍15min,經(jīng)視交叉水平行冠狀切片(共A、B、C、D、E 5個(gè)腦片),C片常規(guī)做石蠟包埋,用做免疫組化和HE染色,其余腦片行T TC染色。各腦片在同等條件下用數(shù)碼相機(jī)正反面拍照,采用病理圖像分析儀系統(tǒng)測(cè)定每片梗死面積及該片總面積,按公式:〔(各片正反面梗死面積之和/2)×片厚〕/〔(各片正反面總面積之和/2)×片厚〕×100%計(jì)算出梗死體積/大腦體積百分比,以此作統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法測(cè)定ET-1的表達(dá):將腦片C置于10%多聚甲醛中行外固定,72 h后常規(guī)石蠟包埋,行冠狀切片,片厚4 μm,切片貼附于經(jīng)APES處理的載玻片上,用SP免疫組織化學(xué)方法測(cè)定ET-1的表達(dá)。每張切片在10×20倍顯微鏡下隨機(jī)選取缺血區(qū)內(nèi)4個(gè)不重疊的視野,計(jì)數(shù)ET-1陽(yáng)性微血管數(shù)。

2 結(jié)果

腦梗死體積測(cè)定:在相同再灌注時(shí)間點(diǎn),拜阿司匹靈組較對(duì)照組腦梗死體積明顯降低(P＜0.01)。見(jiàn)表1。免疫組化結(jié)果:在相同再灌注時(shí)間點(diǎn),拜阿司匹靈組較對(duì)照組ET-1陽(yáng)性表達(dá)明顯降低。見(jiàn)表2。

表1 腦梗死體積在2組再灌注各時(shí)間點(diǎn)的比較(梗死體積/總體積百分比)

表2 ET-1在2組再灌注各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)結(jié)果

3 討論

腦缺血再灌注損傷的機(jī)制包括一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸的毒性作用,凋亡相關(guān)基因的表達(dá)、自由基的形成、線粒體功能紊亂等。這些因素相互作用引起神經(jīng)元的死亡。

高血糖能加重腦缺血損傷。在腦缺血損害很短時(shí)間內(nèi),葡萄糖過(guò)多,發(fā)生無(wú)氧酵解,從而使細(xì)胞乳酸過(guò)多堆積而發(fā)生酸中毒,加重神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損害;此外腦缺血時(shí)高血糖能顯著引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的改變,內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能障礙[2]。阿司匹林作為臨床常用藥,在缺血性腦血管病治療與二級(jí)預(yù)防中的神經(jīng)保護(hù)作用,已得到臨床醫(yī)生的廣泛共識(shí)。但是在腦缺血再灌注和高血糖雙重?fù)p害下,拜阿司匹靈是否也具有神經(jīng)保護(hù)作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),在高血糖狀態(tài)下,在相同的再灌注時(shí)間點(diǎn),拜阿司匹靈組較對(duì)照組梗死體積明顯減小,我們可以通過(guò)觀察ET-1的表達(dá)探討拜阿司匹靈在高血糖狀態(tài)下,減小梗死體積的分子機(jī)制,即在高血糖狀態(tài)下,拜阿司匹靈的神經(jīng)保護(hù)作用。

內(nèi)皮素是目前所知最強(qiáng)的長(zhǎng)效血管收縮劑。神經(jīng)組織、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在有ET。ET-1主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),在神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)也有廣泛分布。腦缺血及缺血再灌注后 ET-1均有增加。ET-1的損傷機(jī)制可能有:(1)促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放和胞外鈣內(nèi)流,使胞內(nèi)鈣超載以及引起微循環(huán)障礙。(2)引起中性粒細(xì)胞聚集黏附。(3)增加氧自由基的產(chǎn)生[3]。(4)使腦組織代謝增加,興奮性氨基酸釋放增多,細(xì)胞內(nèi)Na+-H+交換增多,細(xì)胞酸中毒,加重腦損害[4]。(5)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的自穩(wěn)態(tài)失衡。(6)破壞血腦屏障的完整性,引起腦水腫[5]。

周慶博等[6]研究發(fā)現(xiàn),在正常血糖下,阿司匹林能夠抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注后ET的分泌。拜阿司匹靈為生物利用度高的腸溶性阿司匹林,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在高血糖狀態(tài)下,再灌注各時(shí)間點(diǎn),拜阿司匹靈組較對(duì)照組ET-1表達(dá)明顯減少,腦梗死體積縮小,差異顯著。因此認(rèn)為,在高血糖狀態(tài)下,拜阿司匹靈仍能夠抑制ET-1的表達(dá),從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。TXA2可能與ET-1引起的血管收縮反應(yīng)有密切關(guān)系,所以拜阿司匹靈可能通過(guò)抑制TXA2的生成,進(jìn)而抑制ET-1的表達(dá);阿司匹林能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化損傷的能力,改善內(nèi)皮細(xì)胞功能,進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞生成ET-1;此外阿司匹林能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中NO合成酶的表達(dá),使NO釋放顯著增加,拮抗 ET-1的合成。

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]Keep RF,Andjelkovic A V,Stamatovic SM,et al.Ischemia-induced endothelial cell dysfunction[J].Acta Neurochir Suppl,2005,95:399-402.

[3]Kasemsri T,Armstend WM.Endothelin production links superoxide generation to altered opioid-induced pial artery vasodilation after brain injury in pig s[J].Stroke,1997,28(1):190-196.

[4]Kita S,Katsuragi T.Endothelin-1 enhances the activity of Na+/Ca2+exchanger ty pe 1 in renal epithelial cell[J].J Cardiovasc Pharmacol,2004,44:S239-S243.

[5]Lo AC,Chen AY,Hung VK,et al.Endothelin-1 overex pression leads to further water accumulation and brain edema after middle cerebral artery occlusion via aquaporin 4 expression in astrocy tic end-feet[J].J Cereb Blood Flow M etab,2005,25(8):998-1011.

[6]周慶博,邵念方,李莉,等.阿司匹林對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中血NO、ET、TNF含量的影響[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2002,15(6):326-328.