王洪鵬 葉 琳 王 馳 陳鴻雁"

粉防堿（TET）是防己科植物粉防己 （Stephania tetrandra S.Moore）的主要活性成分。資料表明粉防己堿具有多種生物學效應，在腫瘤防治等方面具有很好的應用前景。研究表明，粉防己堿能明顯增強柔紅霉素（DNR）和長春新堿（VCR）殺傷白血病細胞的能力[1]。但是粉防己堿對鼻咽癌耐藥細胞株作用報道較少?；熕幬飳е录毎芷诎l(fā)生變化，細胞增殖受到抑制，最終誘發(fā)細胞調(diào)亡從而殺傷腫瘤細胞，這是化療藥物的常見機制之一[2]。有關(guān)抗腫瘤藥物對細胞周期的影響報道較多，但藥物相互作用引起耐藥細胞和非耐藥細胞細胞周期變化的文獻報道較少。本研究以鼻咽癌HNE-1細胞株為研究對象，采用流式細胞儀分別檢測天然藥物TET和VRP分別與4種常用抗腫瘤藥物聯(lián)合應用對兩細胞株細胞周期的影響，并進行比較，為進一步探討TET的臨床藥理作用提供基礎(chǔ)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細胞系和照射、培養(yǎng)條件：人鼻咽癌（HNE-1）細胞株，由重慶醫(yī)科大學醫(yī)學超生工程研究所惠贈。（2）試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBlo，USA.），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），鹽酸維拉帕米注射液（VCR，購自上海禾豐制藥有限公司）；TET（標準品，濃度98%，購自浙江金華制藥廠），二甲基亞砜 （DMSO，分析純，蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院），四甲基偶氮唑鹽（MTT，北方同正生物制品公司）。（3）儀器：二氧化碳孵箱 （美國LRBODEL），超凈工作臺 （蘇州凈化設(shè)備廠），倒置顯微鏡 （重慶光學儀器廠，XSZ-D2型），Varian 600C型直線加速器（美國）；光學顯微鏡（Olympus）；超低溫冰箱（-86℃，Nuaire，美國）；Mikro 22R 低溫高速離心機（Hettich，德國）；臺式離心機（LD4-2，北京醫(yī)用離心機廠）；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海躍進醫(yī)療器械廠）；流式細胞儀FACSCalibar（BECTONDICKINSON，美國）。

1.2 方法 （1）分組：1組為VCR+TET，VCR+VRP；2組為BLM+TET，BLM+VRP；3組為 5-FU+TET，5-FU+VRP；4組為DDP+TET，DDP+VRP。將上述每組中的兩種藥物分別處理HNE-1實驗細胞。以不加任何藥物的HNE-1、細胞為對照組。（2）FCM檢測不同藥物作用下細胞的周期改變：取對數(shù)生長期 HNE-1（1 × 107/mL），以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 2 次，加入3mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)液使細胞同步化，12h后將無血清培養(yǎng)液棄去，換為3mL含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，除對照組外，為4種抗腫瘤藥分別與TET、VRP聯(lián)用，各藥物加入量分別為 TET （1.5ug/mL）、VRP（0.1ug/mL）VCR（1.5ug/mL）、BLM（1.5ug/mL）、DDP（1.0ug/mL）、5-Fu（2.1ug/mL）。24h 后收集細胞，胰酶消化，PBS液洗滌2次，乙醇固定后，0.05%PI染色30min，上機檢測，以Modfit LT 2.0軟件分析細胞周期。以上藥物濃度由本課題組前期研究得出，為抑制率低于10%的低毒劑量。

2 結(jié)果

2.1 對照組細胞周期的測定 不加任何藥物的HNE-1細胞周期分布：G0/G1為45.44%，S為45.07%，G2/M為9.49%。

2.2 各用藥組藥物對HNE-1細胞周期的影響 見表1～表4。表1示VCR與VRP、TET聯(lián)用使細胞在G0/G1期阻滯；表2示BLM與VRP作用，使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，處于該期的HNE-1細胞為79.95%；BLM與TET作用，使細胞發(fā)生G2/M期阻滯，處于該期細胞數(shù)為50.77%；表3示TET和5-Fu藥物相互作用促使細胞周期變化，發(fā)生明顯的G0/G1期阻滯；表4示TET和DDP藥物相互作用促使細胞周期變化，發(fā)生明顯的 G0/G1期阻滯。綜上所述，可知：（1）TET、VRP與4種抗腫瘤藥物相互作用結(jié)果相似，均可導致實驗細胞株發(fā)生G0/G1阻滯。（2）DDP和5-Fu與 TET、VRP相互作用較 VCR和BLM顯著。

表1 VCR與藥物相互作用對細胞周期的影響

表2 BLM與藥物相互作用對細胞周期的影響

表3 5-Fu與藥物相互作用對細胞周期的影響

表4 DDP與藥物相互作用對細胞周期的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，TET具有極強的體外逆轉(zhuǎn)MDR的作用，其體外逆轉(zhuǎn)MDR的活性是維拉帕米的10倍，能完全逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR和KBV200細胞株的耐藥性，其機制為通過調(diào)節(jié)P-gp增強MDR相關(guān)性藥物的細胞毒性[3]。Hollstein等[4]的體內(nèi)實驗證明，TET在體內(nèi)能通過降低多藥耐藥基因表達和DNA拓撲異構(gòu)酶活性而干擾多藥耐藥的產(chǎn)生。總之，現(xiàn)有研究表明，TET毒副作用小，不影響化療藥物藥代動力學，是非常具有開發(fā)前景的新一代MDR逆轉(zhuǎn)劑[5，6]。但是粉防己堿在頭頸腫瘤細胞周期方面的研究鮮有報道。

抗腫瘤藥物常通過引起腫瘤細胞DNA損傷而導致細胞周期阻滯。有DNA損傷的細胞常被阻滯在G1期，防止受損的DNA進入S期復制；或被阻滯在G2期，以防止在M期進行異常分裂[3]。將細胞阻滯在G1期或G2期，會使大部分含DNA損傷的細胞在未得到修復的情況下進入細胞分裂期，導致細胞的增殖性死亡增加，理論上能夠提高化療的敏感性。在長期的臨床實踐及實驗研究中，人們已發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物與中醫(yī)藥聯(lián)合應用能提高臨床療效，優(yōu)于單純西藥治療，但對其機制的了解還不夠深入。

本研究以鼻咽癌HNE-1細胞株為研究對象，采用流式細胞儀檢測天然藥物TET和VRP與4種常用抗腫瘤藥物聯(lián)合應用對兩細胞株細胞周期的影響，結(jié)果顯示，TET與腫瘤藥物相互作用，可使鼻咽癌耐藥細胞株和非耐藥細胞株均產(chǎn)生細胞G1期阻滯，抑制細胞增殖，這與經(jīng)典化療增敏劑VRP相似，其中VCR與藥物相互作用結(jié)果同BLM相似，而DDP和5-Fu結(jié)果相似，其作用較VCR和BLM顯著。本研究顯示，天然藥物TET和經(jīng)典化療增敏劑VRP均能通過誘導鼻咽癌細胞G1期阻滯從而產(chǎn)生化療增敏作用，這為進一步將TET作為化療增敏劑和腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供了依據(jù)。

[1]戴春嶺，符立梧，等.腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究進展[J].中國實驗診學，2005，4（9）：513 ～517.

[2]Zhang LP，Jiang JK，Tam JW ，et al.Effect ofmatrine on proliferation and differentiation in K-562 cells[J].Leuk Res，2001，25（9）：793.

[3]Wang Q，F(xiàn)an S，Eastman A，et al.UCN-01:a potentabrogator of G2 checkpoint function in cancer cellswith disrupted p53[J].JNaltCancer Inst，1996，88：956 ～ 965.

[4]Hollstein M，Sidransky D，Vogelstein B，et al.p53 mutation in human cancers[J].Science，1991，253：49 ～ 53.

[5]李永生，張炎.粉防己堿逆轉(zhuǎn)P-gp介導的膀胱腫瘤多藥耐藥的實驗研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2003，13（2O）：82-90.

[6]王進.粉防己堿逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞系多藥耐藥性的研究 [J].實用臨床醫(yī)學，2005，6（7）：7 ～ 10.

[7]Hartwell LH，Kastan MB.Cell cycle control and cancer[J].Science，1994，266：1821 ～1828.

[8]Takara K，Sakaeda T，Tanigawara Y，et al.Effects of 12 Ca2+antagonists on multidrug resistance，MDR1-mediated transport and MDR1 mRNA expression[J].Eur JPharm Sci，2002 ，16（3）：159 ～ 65.

[9]Taguchi T，Kato Y，Baba Y，et al.Protein levels of p21，p27，cyclin E and Bax predict sensitivity to cisplatin and paclitaxel in head and neck squamous cell carcinomas[J].Oncol Rep，2004，11（2）：421 ～426.