黃偉明， 陳綿才， 肖彤斌， 王會(huì)芳

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，儋州 571737；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護(hù)所，?？?571100）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是一類可侵害多種農(nóng)作物的重要植物土傳病原物，全世界每年因其造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1 000億美元以上［1］，對(duì)蔬菜、花生、煙草和果樹造成的產(chǎn)量損失超過20%［2］。海南地處熱帶，冬季蔬菜種植已成為促進(jìn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的重要支柱產(chǎn)業(yè)。以瓜類、茄果類和豆類為主體的反季節(jié)瓜菜年栽培面積約10萬hm2。由于可耕地面積有限，使得土地復(fù)種指數(shù)逐年提高，許多菜區(qū)甚至連年栽種相同類型的作物，造成產(chǎn)量和品質(zhì)不同程度下降，其中一個(gè)最主要原因是根結(jié)線蟲病的不斷累積、傳播、蔓延和危害所致。至目前國內(nèi)已報(bào)道的根結(jié)線蟲近40種，寄主涉及2 000多種植物，但不同生境下其種類分布復(fù)雜，種間乃至種內(nèi)存在著一定的寄主?；裕?］。作者針對(duì)海南島獨(dú)特的地理和氣候條件下根結(jié)線蟲侵染葫蘆科蔬菜的狀況進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)病原的種類進(jìn)行鑒定，以期為當(dāng)?shù)厥卟烁Y(jié)線蟲病綜合防治技術(shù)體系的組建和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根結(jié)線蟲危害性調(diào)查

于2008年10月至2009年2月從海南島11個(gè)市縣葫蘆科蔬菜主產(chǎn)區(qū)采樣，采樣點(diǎn)及寄主如表1。選取受害嚴(yán)重植株，挖開表土，觀察其根部根瘤數(shù)量，判斷是否感染根結(jié)線蟲，并拍照。按五點(diǎn)法取樣，每點(diǎn)調(diào)查2株，每塊地共調(diào)查10株，進(jìn)行病情分級(jí)和記載，計(jì)算根結(jié)指數(shù)。

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)－根系無根結(jié)；1級(jí)－根系有少量根結(jié)；3級(jí)－2／3根系有蟲癭；5級(jí)－根系布滿小根結(jié)，并有次生根結(jié)；7級(jí)－根系形成根結(jié)團(tuán)［4］。

1.2 樣本采集與培養(yǎng)

挖取根部土壤約500 g和染病根，置于塑料袋中，封口并標(biāo)記。溫室條件下將病根和病土接種到預(yù)先用滅菌土培植的盆栽番茄上，保存線蟲原始種群，45 d后從染病番茄根系上挑取單卵塊進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.3 會(huì)陰花紋制作與鑒定

用挑針在體視顯微鏡下解剖根結(jié)，每個(gè)種群挑取成熟雌蟲20頭移入硬塑料板上清水滴中，剔除雜物并進(jìn)行修切，清水中清洗3次，然后將包含完整會(huì)陰花紋且大小合適的角質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到載玻片上，加蓋玻片。干燥后，在顯微鏡下觀察會(huì)陰花紋的形態(tài)特征并拍照。

1.4 同工酶分析

根結(jié)線蟲的蘋果酸脫氫酶（Mdh）和酯酶（Est）同工酶的活性分析參照Esbenshade等的程序［5］。采用7%聚丙烯酰胺膠垂直電泳，膠厚為1.5 mm，每孔加入20頭純化培養(yǎng)的年輕雌蟲酶提取物。電泳后，將膠在蘋果酸脫氫酶染液中染色5～10 min至出現(xiàn)清晰的酶條帶，然后將同一膠在酯酶染色液中染色20～30 min至出現(xiàn)清晰的酶條帶為止。以已鑒定的爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）樣本作為參照系。蘋果酸脫氫酶和酯酶表型的命名按照Esbenshade等的方法［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲危害性

調(diào)查結(jié)果表明，海南島葫蘆科蔬菜受根結(jié)線蟲的危害嚴(yán)重，被調(diào)查菜田的株發(fā)病率均在50%以上，澄邁縣的絲瓜和苦瓜、瓊中縣的南瓜發(fā)病率高達(dá)100%。瓊海中原、瓊中腰子、臨高多文、澄邁長(zhǎng)安、臨高龍波、瓊中營根、五指山茶場(chǎng)、定安雷鳴等8個(gè)主產(chǎn)菜區(qū)的病情指數(shù)均超過30。其中瓊中腰子、澄邁長(zhǎng)安和瓊中營根3個(gè)采樣點(diǎn)的病情指數(shù)分別達(dá)到了47.12、47.14和40（表1）。

表1 海南葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲危害調(diào)查結(jié)果

2.2 根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)雌蟲會(huì)陰花紋進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)雌蟲會(huì)陰花紋變異很大，初步認(rèn)為寄生于葫蘆科蔬菜的根結(jié)線蟲種類有南方根結(jié)線蟲（Meloidogyneincognita）、爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）和疑似新種或新紀(jì)錄種（Meloidogynesp.）。

南方根結(jié)線蟲形態(tài)特征描述：雌雄異形，雌蟲蟲體膨大，呈球形或梨形，有明顯突出的頸部，唇區(qū)稍突起，略呈帽狀；會(huì)陰花紋變異較大：花紋呈橢圓形或近圓形，通常背弓高，背弓頂部圓或平，有時(shí)呈梯形，背紋緊密：花紋背面和側(cè)面的線紋呈波浪形或鋸齒狀，有的平滑，側(cè)線不明顯，側(cè)面線紋有時(shí)分叉。2齡幼蟲線形［7］。所有調(diào)查的市縣均有分布。

爪哇根結(jié)線蟲形態(tài)特征描述：雌雄異形，雌蟲蟲體膨大，近球形至洋梨形，有突出的頸部，唇區(qū)有1個(gè)環(huán)紋；會(huì)陰花紋背弓圓而扁平，線紋平滑至波浪形，有一清楚的側(cè)線將花紋的背線和腹線分開，分為明顯的背區(qū)和腹區(qū)，一般無線紋通過側(cè)線。2齡幼蟲線形［8］。主要分布在臨高、五指山和萬寧3個(gè)市縣。

疑似新種或新紀(jì)錄種Meloidogynesp.形態(tài)特征描述：雌雄異形，雌蟲蟲體膨大，呈球形或梨形，有突出的頸部，唇區(qū)稍突起，呈錐狀；會(huì)陰花紋肩部明顯，背弓高，線紋平滑，側(cè)線不明顯，側(cè)面線紋分叉明顯。2齡幼蟲線形。主要分布在瓊海和儋州。

圖1 海南省侵染葫蘆科蔬菜的根結(jié)線蟲雌蟲代表性會(huì)陰花紋（400×）

2.3 同工酶鑒定結(jié)果

在供試種群中，共測(cè)得酯酶譜帶類型3種，結(jié)合比較形態(tài)學(xué)特征，分別判定為I1（Rf為0.470），代表M.incognita的酯酶譜帶類型；J3（Rf為0.460、0.545和0.590），代表M.javanica的酯酶譜帶類型；S1－M2a（Rf為0.465和0.480），基于其獨(dú)特性，認(rèn)為代表1個(gè)疑似新種或新紀(jì)錄種Meloidogynesp.的酯酶譜帶類型（圖2）。

圖2 海南省侵染葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲群體的蘋果酸脫氫酶和酯酶表型

通過同工酶電泳技術(shù)與比較形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法，鑒定了海南島葫蘆科蔬菜上24個(gè)根結(jié)線蟲種群，有19個(gè)屬于南方根結(jié)線蟲，占總數(shù)的79.17%；有3個(gè)屬于爪哇根結(jié)線蟲，占總數(shù)的12.5%；有2個(gè)屬于疑似新種或新紀(jì)錄種Meloidogynesp.，占總數(shù)的8.3%。南方根結(jié)線蟲是海南葫蘆科蔬菜上的優(yōu)勢(shì)種。

3 結(jié)論與討論

海南島葫蘆科蔬菜嚴(yán)重遭受根結(jié)線蟲危害，所調(diào)查的主產(chǎn)區(qū)植株發(fā)病率均高于50%，這與該地區(qū)土地利用率增高有關(guān)。海南島是我國反季節(jié)蔬菜的重要種植基地，復(fù)種指數(shù)的增加，導(dǎo)致了根結(jié)線蟲種群數(shù)量在土壤中逐年增大，生產(chǎn)上應(yīng)引起注意。建議采用水旱輪作，延長(zhǎng)非寄主作物的種植年限，降低根結(jié)線蟲基數(shù)，有條件的地方可以采取陽光消毒和生物熏蒸的措施，以減少土壤中的線蟲數(shù)量。

運(yùn)用比較形態(tài)學(xué)和同工酶方法鑒定出海南葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和1個(gè)疑似新種或新記錄種，其中南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種，這與前人報(bào)道的結(jié)果基本相符［9－10］。疑似新種或新紀(jì)錄種的形態(tài)學(xué)和同工酶譜帶均有別于常見4個(gè)種，但由于獲得和掌握可比對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的局限性，有待于進(jìn)一步開展其分子特征觀察與遺傳背景分析予以準(zhǔn)確鑒定與描述。

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