張松柏, 張德詠, 劉 勇, 羅香文, 成飛雪, 彭兆普, 馬明勇
(湖南省植物保護(hù)研究所,長沙 410125)
湖南是我國的水稻生產(chǎn)大省,水稻面積和總產(chǎn)均居全國首位,不僅為湖南省經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國家糧食安全提供了堅(jiān)強(qiáng)保障,而且為世界水稻科學(xué)的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)[1]。
2009年湖南省包括長沙在內(nèi),全省有61個(gè)縣市區(qū)在一季中稻和雙季晚稻上都發(fā)生了一種病害。其癥狀類似水稻黑條矮縮病,全株矮縮叢生,有的能抽穗,但抽穗相對(duì)晚而小,半包在葉鞘里;劍葉短小僵直,中上部葉片基部可見縱向皺褶;莖稈可見乳白色或褐色的條狀隆起;莖稈節(jié)部出現(xiàn)氣生須根。據(jù)湖南省植保站不完全統(tǒng)計(jì),受害面積達(dá)到幾萬公頃,絕收面積達(dá)數(shù)千公頃,造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到數(shù)千萬元[2]。更嚴(yán)重的是,如果不及時(shí)查明病因,采取有效的防治策略,將嚴(yán)重威脅湖南的水稻生產(chǎn)。
20世紀(jì)60年代和90年代,水稻黑條矮縮病曾在我國華北、華東等地大規(guī)模流行,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4],南方黑條矮縮病在我國的海南和廣東兩省從2001年開始就有發(fā)生的報(bào)道,并逐步擴(kuò)散[5-7]。但是,湖南省未見水稻黑條矮縮病和南方水稻黑條矮縮病發(fā)生危害的報(bào)道。本文根據(jù)田間水稻受害癥狀、病毒粒子電鏡觀察以及病毒S10部分序列分析確定造成2009年湖南水稻大面積矮縮的病因。
試驗(yàn)樣品分別采自湖南省懷化、岳陽、寧鄉(xiāng)等地矮縮的水稻。水稻樣品凍存于-70℃冰箱。
參考Zhou等[6]的方法,取矮縮水稻樣品葉組織經(jīng)鋨酸-戊二醛固定后,切取側(cè)脈組織用環(huán)氧樹脂包埋,常規(guī)方法切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色,在JEOL-1230型透射電子顯微鏡下觀察拍照。
水稻樣品總RNA的提取采用總RNA分離試劑盒(天根生物)抽提,具體操作參照說明書。
以水稻樣品總RNA為模板,One Step RNA PCR Kit(天根生物)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。SRBSDV特異性檢測引物 (S10-F:5′>CGCGTCATCTCAAAACTACAG<3′,S10-R:5′>TTTGTCAGCATCTAAAGCGC<3′),RT-PCR 步驟和參數(shù)參考文獻(xiàn)[5-6]。RBSDV 特異檢測引物(S10-U:5′>TTGTAGTTCAAACTCATAAAGG<3′,S10-L:5′>CATCAGCGGAAAAG GGCTTC<3′),RTPCR步驟和參數(shù)參考文獻(xiàn)[7],SRBSDV/RBSDV擴(kuò)增片段大小約為700bp。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。
以水稻總RNA RT-PCR產(chǎn)物為底物,利用引物S10-F/S10-R重新 PCR,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,切膠回收目的片段,以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程(大連)有限公司),回收后的目的片段由上海生工生物工程(大連)有限公司測序。
測序所得病毒基因組片段S10部分序列登入GenBank數(shù)據(jù)庫,利用Blast N比較相似性。利用DNAStar 5.01中的EditSeq程序計(jì)算核苷酸序列參數(shù)。以Mega 3.1程序采用ClastW方法進(jìn)行多序列聯(lián)配,并采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
湖南省懷化分離物部分S10序列(HH_isolate):HH114214;湖南省岳陽分離物部分S10序列(YY_isolate):HHM114212;湖南省寧鄉(xiāng)分離物部分S10序列(LX_isolate):HM114213。
從湖南省懷化、岳陽、寧鄉(xiāng)等3地采集的水稻矮縮樣品,其癥狀表現(xiàn)為植株矮縮、葉色深綠(圖1a)、莖稈出現(xiàn)點(diǎn)條狀乳白色或淺褐色小突起、高位分蘗及莖節(jié)部出現(xiàn)氣生須根(圖1b)。
圖1 感染水稻癥狀
湖南懷化矮化水稻樣品的葉片超薄切片電鏡觀察表明,在感病水稻葉片韌皮部細(xì)胞內(nèi)存在典型的斐濟(jì)病毒侵染特征[6]。受侵染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的病毒粒子聚集形成的深色區(qū)域。
圖2 感染水稻葉片韌皮部超薄切片透射電鏡圖(×15 000)
RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3,從湖南省懷化、岳陽、寧鄉(xiāng)等3地采集的矮縮水稻樣品中,RBSDV特異引物未擴(kuò)增到目的條帶;SRBSDV特異引物擴(kuò)增到大小約700bp左右的條帶。因此,可以推定造成湖南省懷化、岳陽、寧鄉(xiāng)等3地水稻矮縮的病原是SRBSDV。
圖3 水稻矮縮樣品RT-PCR電泳圖
測定的湖南省懷化、岳陽、寧鄉(xiāng)等3地水稻樣品的SRBSDV部分S10片段的長度為684bp,Blast結(jié)果表明,YY_isolate、LX_isolate、HH_isolate與SRBSDV/RBSDV-2相應(yīng)的序列相似性>98%,與RBSDV的幾個(gè)分離物相應(yīng)的序列相似性為82%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,湖南的3個(gè)分離物的部分S10序列與SRBSDV/RBSDV的相應(yīng)序列聚為一個(gè)分類簇(圖4)。
圖4 測定的感染水稻樣品中SRBSDV片段S10部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析
本研究通過2009年湖南省3個(gè)地區(qū)矮縮水稻樣品的癥狀、病毒粒體及細(xì)胞病理學(xué)觀察以及病毒分離物基因組S10片段部分序列分析,推定引起2009年水稻大面積矮縮的病原是南方水稻黑條矮縮病毒。
病害癥狀和病原物形態(tài)是病害鑒定的重要依據(jù),從湖南省3個(gè)地區(qū)采集的發(fā)病水稻樣品都具有Zhou等[6]采自海南省發(fā)病水稻的一些特異特征如植株矮縮、葉色深綠(圖1a)、高位分蘗、莖稈出現(xiàn)點(diǎn)條狀乳白色或淺褐色小突起、莖節(jié)部出現(xiàn)氣生須根(圖1b)。病毒粒子的透射電鏡結(jié)果顯示,在感病水稻葉片中存在典型的斐濟(jì)病毒屬病毒粒子的特征[8]。
基因組序列差異作為病毒分類最重要的指標(biāo),在斐濟(jì)病毒的 分 類 中 已 被 廣 泛 應(yīng) 用[4-7,9-11]。 根 據(jù) 斐濟(jì)病毒屬其他成員研究結(jié)果推導(dǎo),S10編碼的產(chǎn)物為病毒外殼蛋白,影響病毒的致病性和介體傳播特性,是斐濟(jì)病毒基因組10個(gè)片段中最為保守的片段之一[6,12],因此也被應(yīng)用于斐濟(jì)病毒屬病害的檢測與鑒定。目前在GenBank中已報(bào)道來自日本及中國的水稻及玉米上的RBSDV各分離物之間S10核苷酸同源性大于90%[5]。
Zhou等[6]根據(jù)海南發(fā)病水稻癥狀特征、傳毒介體以及分離物S9/S10序列及推導(dǎo)蛋白序列特征,建議將該海南省分離物列為呼腸孤病毒科斐濟(jì)病毒屬第2組的一個(gè)新種,命名為南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV);幾乎與之同時(shí),Zhang等[4]也測定了廣東水稻分離物的片段S7-S10的序列,命名為RBSDV-2。其中片段S9-S10與SRBSDV的對(duì)應(yīng)片段序列相似性高達(dá)98%~99%。據(jù)此Zhang等[4]認(rèn)為這兩個(gè)地區(qū)的分離物是同一個(gè)種的不同分離物。這兩個(gè)分離物的基因組S10序列與已報(bào)道的RBSDV相應(yīng)序列的相似性<80%,因此,Zhou等[6]建議將發(fā)生在華南地區(qū)的該病害命名為南方水稻黑條矮縮病。
湖南省3個(gè)地區(qū)發(fā)病水稻分離物S10片段部分序列與已報(bào)道的SRBSDV/RBSDV-2的相應(yīng)部分序列的相似性高達(dá)98%以上,與已報(bào)道的RBSDV相應(yīng)序列的相似性為82%,且利用RT-PCR未檢測到RBSDV,據(jù)此,將導(dǎo)致2009年湖南省水稻大面積矮縮的病害鑒定為南方水稻黑條矮縮病。
RBSDV曾在我國水稻、玉米等作物上大面積危害,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。從2001年開始,SRBSDV/RBSDV-2[5-6]在我國華南部分地區(qū)引起水稻及(甜)玉米發(fā)病,并且逐年擴(kuò)展危害;湖南省2009年南方水稻黑條矮縮病大面積發(fā)生,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,表明南方水稻黑條矮縮病在我國擴(kuò)展迅速。Zhou等[6]的研究還表明,SRBSDV的主要傳毒介體是白背飛虱。白背飛虱為我國及亞洲許多國家和地區(qū)的主要害蟲之一,是一種典型的遷飛性害蟲[13],而且白背飛虱為害多種禾本科作物[14],這暗示南方水稻黑條矮縮病對(duì)我國水稻及玉米等禾本科作物具有非常大的潛在危害,迫切需要對(duì)其進(jìn)行流行學(xué)及發(fā)生規(guī)律研究。
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