張 超 夏亞一 李 鵬 何萬慶 王海明 汪 靜 王翠芳

(蘭州大學第二醫(yī)院骨科研究所,蘭州 730030)

自 1997年發(fā)現(xiàn)骨保護素(osteoprotegerin,OPG)和細胞核因子 κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)后,大量的研究結(jié)果顯示 OPG與 RANKL的平衡直接影響著骨組織代謝[1,2]。RANKL是一種膜結(jié)合蛋白,它可以和前破骨細胞上的細胞核因子κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)結(jié)合從而激活前破骨細胞[3],使其分化為破骨細胞,故也稱為破骨細胞分化因子(osteoclastdifferentiation factor,ODF),在骨質(zhì)形成和吸收中發(fā)揮作用。間質(zhì)和成骨細胞都可表達OPG,它是RANK的一種競爭性抑制劑[4],OPG與RANKL結(jié)合不但阻止骨組織的吸收,而且減少了破骨細胞的產(chǎn)生。因此,深入探討流體剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下 OPG和 RANKL的蛋白表達機制是很有必要的。以往的研究證實,應力刺激可以影響成骨細胞中前列腺素 E2(PGE2)、雌激素、TNF、IL、等因子的表達[5～7],這些因子又分別通過不同的途徑對 OPG和 RANKL的表達產(chǎn)生影響,進而調(diào)節(jié)骨組織的代謝。本實驗通過研究處于骨組織代謝中心環(huán)節(jié)的兩種分子 OPG和 RANKL在不同時段的流體剪切力作用下蛋白表達的變化,探討流體剪切力對促進骨組織形成和抑制骨組織吸收的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

將小鼠胚胎細胞系 MC3T3-E1細胞植入無菌細胞培養(yǎng)瓶中,瓶中加入含有 10%胎牛血清和 100 U/ml青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基,放入溫度 37℃、CO2飽和度 5%的孵育箱中培養(yǎng),細胞每隔 3天換液一次。同時觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài),當細胞生長面積達到瓶底面積的 80%時,用 0.25%胰酶 -0.1%Ⅱ型膠原酶消化,按照 5×105個細胞接種于無菌培養(yǎng)瓶中,取第三代穩(wěn)定的傳代細胞用于應力加載實驗。

1.2 應力加載裝置

應力加載系統(tǒng)由蠕動泵、硅膠導管、流體小室、儲液管組成。儲液管、硅膠導管和流體小室形成了一個閉合的回路,用蠕動泵擠壓使得液體流動。其中流體小室由兩塊透明的有機玻璃組成,上方的有機玻璃前端和后端分別有進液口和出液口通過硅膠導管與儲液管相連,下方的有機玻璃板中間鑿有載玻片大小的凹槽,以便載玻片全部卡入凹槽,使細胞受到流體剪切力作用。流體小室的尺寸設計基于Poiseuille流動腔模型[8],置入蓋玻片的凹槽長5cm,寬 2.5cm,高 0.2mm。該凹槽的大小滿足長、寬遠遠大于高,長/高遠遠大于 10,能夠保證液體流過時層流、二維流動充分發(fā)展為標準的液流,使得實驗細胞均勻受力。流室底面剪切力計算公式是：τ=6ηQ/H2×W。η：流體液的黏滯系數(shù)(dyn/cm2);Q：單位時間內(nèi)流經(jīng)流體小室的液量(cm2/s);H：流室高度(cm);W：流室寬度(cm)。

1.3 細胞爬片加力

對狀態(tài)良好的 MC3T3-E1細胞進行消化,按照1×106個細胞均勻接種到放有蓋玻片(用Ⅰ型鼠尾膠原包被,以便細胞爬片)的無菌培養(yǎng)皿中,每次傳4個培養(yǎng)皿,每個皿中放入3張蓋玻片(10張進行實驗,即 OPG和 RANKL實驗組各 5張,分別加載 0,30,60,90,120min的流體剪切力;另外 2張作為備用),然后將培養(yǎng)皿置于 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),待細胞均勻爬滿蓋玻片,以備加力時使用。將滅菌后的加力裝置連接好放入37℃恒溫箱內(nèi),儲液管中加入 40 ml培養(yǎng)基作為流體液。在無菌條件下,迅速取出爬滿細胞的蓋玻片,細胞面向上嵌入流體小室下層的凹槽中,啟動精密蠕動泵提供 12 dyn/cm2的流體剪切力對細胞進行加力,加力裝置連接 5%CO2以維持流體液 pH值在 7.2～7.4之間。

1.4 免疫熒光實驗

將完成加力后的蓋玻片放入準備好的培養(yǎng)皿中,用 0.01%磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗 10 min,吸出洗液加入 4%多聚甲醛固定細胞,室溫孵育 10min,棄多聚甲醛后 PBS沖洗 3次,每次 5 min,加入 0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)透化去交聯(lián) 5min,棄 TritonX-100后 PBS沖洗 10min,加入 1%牛血清白蛋白封閉非特異性位點 30min,PBS沖洗 10min,棄液。每張爬片滴加 30μl稀釋好的一抗(1∶100),放入濕盒 4℃冰箱孵育過夜。次日,PBS沖洗 3次,每次 10 min,避光條件下加入 30μl稀釋好的二抗(1∶150),室溫孵育 30min,PBS沖洗 3次,每次 10 min,封片后熒光顯微鏡下鏡檢每張玻片選 2個不同的視野拍照。以上實驗重復 3次,用 IPP軟件分析各水平蛋白表達的累積光密度值。

1.5 蛋白印跡實驗

將完成加力的蓋玻片迅速放入冰盒內(nèi),PBS沖洗 2次,加入細胞裂解液進行裂解,所得的產(chǎn)物即為總蛋白,運用 Bradford法可以測定各加力水平細胞的總蛋白濃度,將樣本以相同的蛋白量加入電泳槽中,選擇 6%(分離膠)和 12%(濃縮膠)的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后用 PBS漂洗 30 min,5%脫脂奶粉封閉 2 h后,再次洗膜 30 min,加入一抗(1∶500)4℃冰箱孵育過夜。次日,再次洗膜 30 min,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(1∶1000),室溫下孵育 60 min,暗室中細胞外基質(zhì)(ECM)顯色液顯影,X光膠片曝光。以上實驗重復 3次,IPP軟件分析各水平蛋白表達的累積光密度值。

1.6 軟件分析

2 結(jié)果

2.1 OPG和 RANKL的蛋白表達

運用 12 dyn/cm2的流體剪切力對 MC3T3-E1細胞分別加載 0,30,60,90,120min后,熒光顯微鏡下觀察 OPG和 RANKL不同時間段的表達情況(圖1)。運用積分光密度值對不同時間段 OPG和RANKL在細胞內(nèi)的表達情況進行半定量分析。結(jié)果顯示：FSS作用 30,60,90,120min后能夠顯著增加 OPG的蛋白表達(P＜0.05),圖1中隨著加力時間的延長,OPG熒光亮度增加,這表明 OPG的蛋白表達相應增加;同時 FSS也可以減少 RANKL的蛋白表達,但是該作用沒有 OPG的變化顯著,圖1中隨著加力時間的延長,RANKL熒光亮度降低,這表明 RANKL的蛋白表達相應減少。兩者共同作用,隨著加力時間的延長,OPG/RANKL值顯著增高(P＜0.05)。具體數(shù)據(jù)見表1。

圖1 OPG和 RANKL在 FSS作用不同時間后免疫熒光表達(×40)

表1 FSS作用不同時間 OPG和RANKL的積分光密度值(免疫熒光)(±s,n=30)

4個實驗組 OPG、RANKL、OPG/RANKL與對照組兩兩比較,均 P=0.000

組別 OPG RANKL OPG/RANKL對照組：0min組 11512.564±131.552 15765.541±97.360 0.730±0.143實驗組：30min組 12350.230±109.356 14586.032±124.183 0.847±0.205 60min組 15583.867±86.423 13662.115±103.854 1.141±0.135 90min組 18436.716±162.928 12974.861±79.481 1.421±0.197 120min組 19155.357±138.721 12539.857±117.587 1.512±0.151 F值P值99.852 0.000 25.149 0.000 62.288 0.000

2.2 OPG及 RANKL蛋白印跡結(jié)果

運用 12 dyn/cm2的流體剪切力對 MC3T3-E1細胞分別加載 0,30,60,90,120 min后,采用 Western blotting方法研究 OPG和 RANKL在不同時間段的表達情況(圖2)。通過積分光密度值對不同時間段OPG和 RANKL在細胞內(nèi)的表達情況進行定量分析。結(jié)果表明：FSS作用30min后,OPG的表達開始增加,當作用 60 min后,OPG的增長趨勢到達高峰,與 0 min相比增加了 50%左右,而后增長趨勢有所減慢,但各組之間增加顯著(P＜0.05);同時 FSS也可以減少 RANKL的表達,這一作用在 90 min時達到高峰,與 0min相比減少了 30%左右,但 RANKL的變化趨勢相對較緩。兩者共同作用,隨著加力時間的延長,OPG/RANKL值顯著增高。具體數(shù)據(jù)見表2。

3 討論

應力包括基底牽張力、流體剪切力和壓應力等,骨細胞所能感受到的應力強度為 8～30 dyn/cm2[9,10]。盡管骨組織特殊的腔隙——小管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)決定了流體剪切力對骨組織的特殊作用[11],但是有關(guān)流體剪切力作用下成骨細胞所做出應答的研究卻較少。本實驗通過調(diào)節(jié)蠕動泵的轉(zhuǎn)數(shù)將流體剪切力控制在 12 dyn/cm2對 MC3T3-E1細胞中 OPG和 RANKL的蛋白表達進行了研究,因為 OPG和RANKL的表達直接影響著成骨細胞和破骨細胞的功能,進而影響著骨組織形成與代謝的動態(tài)平衡,因此將 OPG/RANKL的比值作為量化成骨活性的標準,從而揭示流體剪切力對骨組織代謝的調(diào)節(jié)作用。

圖2 OPG和 RANKL在 FSS作用不同時間后蛋白印跡表達

表2 FSS作用不同時間 OPG和RANKL的積分光密度值(蛋白印跡)(±s,n=30)

表2 FSS作用不同時間 OPG和RANKL的積分光密度值(蛋白印跡)(±s,n=30)

各實驗組與對照組兩兩比較,OPG 0min vs 30min P=0.011,RANKL 0min vs 30min P=0.007,其余均 P=0.000

組別 OPG累積光密度值 RANKL累積光密度值 OPG/RANKL對照組：0min組 1356.522±35.764 4596.614±58.260 0.293±0.142實驗組：30min組 1840.176±48.358 3673.850±42.873 0.506±0.131 60min組 3245.201±41.701 2407.621±49.337 1.335±0.165 90min組 4022.183±59.235 2086.316±37.641 1.940±0.170 120min組 4470.967±51.639 1782.365±31.353 2.511±0.149 F值 109.757 51.297 76.173 P值 0.000 0.000 0.012

Tyrovola等[12]證實 RANKL可以與前破骨細胞上的 RANK結(jié)合從而激活前破骨細胞,使其分化為破骨細胞,使得骨組織向著加速吸收的方向發(fā)展。而 OPG是 RANK的一種競爭性抑制劑,OPG與RANKL結(jié)合不但阻止骨組織的吸收,而且減少了破骨細胞的產(chǎn)生。本實驗中,空白組(0min)細胞處于靜態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)下,OPG的表達較少,相應的 RANKL的蛋白表達則較為豐富。隨著培養(yǎng)時間的延長,RANKL的表達繼續(xù)增加,這導致 OPG/RANKL的比值降低,RANKL的增多可以促進破骨細胞的形成,使骨組織代謝向著加快吸收的方向發(fā)展,這也許可以說明長期臥床缺乏運動的病人由于應力對骨骼的刺激減少,使得 OPG的表達減少,相反 RANKL的表達增加,破骨細胞形成增多,最終導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

成骨細胞對 FSS的響應要經(jīng)歷一個短暫的潛伏期,但 FSS的作用較顯著。加力 30min后,阻滯了OPG/RANKL變小的趨勢,蛋白檢測提示 FSS促進了 OPG的表達,抑制了 RANKL的表達,二者的協(xié)同作用使 OPG/RANKL的比值較 0 min組有所增加,但這種增加較輕微,可能是 FSS對 MC3T3-E1細胞的作用要經(jīng)歷一個短暫的潛伏期。盡管 Rubin等[13]運用基底形變給小鼠骨細胞加力也使得OPG/RANKL的比值增加,但是與基底牽張力只減少RANKL的量相比,本實驗中 FSS一方面增加 OPG的表達,另一方面還減少 RANKL的表達,使OPG/PANKL的比值增加更顯著。

骨骼細胞對流體剪切力作用更加敏感且有效。加力 60min后,OPG/RANKL的比值增長最為顯著。在這一時期,FSS進一步促進了 OPG的表達,相反RANKL的蛋白表達則被抑制。FSS在促進成骨細胞產(chǎn)生的同時也抑制了破骨細胞的形成和活化,從而抑制了骨組織的吸收,使得骨組織向著成骨的方向發(fā)展。Wang等[14]用基底牽張力給成骨細胞加力,需要 6～12 h的連續(xù)作用才能有效,而 FSS的作用在 60min后就顯示出同樣的效果,這說明成骨細胞對 FSS響應更快。各種形式的應力最終以牽拉和剪切的形式作用于骨骼細胞,其中又以 FSS作用最為重要。劉易軍等[15]證實,FSS可以在很短時間內(nèi)增加細胞內(nèi)鈣離子的水平,可在數(shù)十分鐘內(nèi)增加前列腺素的產(chǎn)量,而前列腺素可以在短時間內(nèi)導致RANKL表達減少,同時使 OPG表達增加。這也與我們的研究不謀而合,加力60min后OPG的表達增加最大,RANKL減少最多,OPG/RANKL增加最顯著。同時,Kanzaki等[16]運用擠壓力對牙周膜細胞進行加力時觀察到,RANKL的表達有所增加,但是OPG的表達沒有發(fā)生變化。Maddi等[17]運用超聲波對成骨細胞進行作用,觀察到與對照相比 OPG的表達明顯增加,但 RANKL的表達無變化。相比之下,本實驗運用 FSS對 MC3T3-E1細胞加力,一方面增加了 OPG的表達,另一方面抑制了 RANKL的表達,二者的協(xié)同作用使 OPG/RANKL顯著增加。這些結(jié)果提示,與其他機械刺激相比,FSS對成骨細胞中 OPG和 RANKL的表達更加有效。

流體剪切力對 OPG和 RANKL的作用影響骨組織形成與吸收的動態(tài)平衡。加力 90 min后,OPG/RANKL的比值仍在增大,但 OPG的增長及RANKL的減少趨勢較 60 min時相對放緩,說明成骨組織逐漸適應了 FSS的作用,對 FSS的敏感性有所下降。在 120 min內(nèi),加力的時間越長,OPG/RANKL的比值增長得越多,這說明對成骨細胞而言FSS可能具有劑量依賴性和可蓄積性。張成俊等[18]證實,一些影響成骨細胞增殖周期的因子CDK 2和 CDK 4對 FSS作用也具有劑量依賴性和可蓄積性。與 Tintut等[19,20]相同,本實驗中流體剪切力對 OPG和 RANKL的作用使得大量的 OPG中和了 RANKL,造成破骨細胞的產(chǎn)生和活化障礙并且促進破骨細胞的凋亡,進一步影響了骨組織新陳代謝的動態(tài)平衡。

在本研究中,流體剪切力對 OPG和 RANKL的影響在蛋白水平被定量化,流體剪切力作為骨組織新陳代謝的重要調(diào)節(jié)器之一得到驗證,流體剪切力對 OPG的上調(diào)和對 RANKL的下調(diào)作用直接影響著成骨細胞和破骨細胞,進而影響骨組織代謝的動態(tài)平衡,有關(guān)這方面的研究將在骨組織形成和修復、生物工程、骨質(zhì)疏松及骨病的研究和治療中發(fā)揮巨大的作用。因此,詳盡地研究流體剪切力與骨組織的關(guān)系對了解骨組織的作用具有重大意義。

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