蘇俊華, 朱莉莉, 陳建華, 保 凌, 趙 勤, 梁桂亮, 楊慧仙, 施巧霞, 段志妹

近年來,結核病的發(fā)病率有上升趨勢。目前全球每年新增病例約800萬例[1],我國是世界上僅次于印度的第2個結核病大國,結核感染率為44.5%,活動性結核患者450萬,每年死亡人數(shù)達13萬[2]。世界衛(wèi)生組織2004年的報告顯示,結核病診斷率僅為37%,即使在發(fā)達國家也僅有50%的結核病例通過細菌學方法被證實[3]。我院常用的細菌學檢測方法是痰、肺泡灌洗液和支氣管毛刷檢物涂片、鏡檢法和培養(yǎng)法,以及分子生物學技術(TB-DNA)檢測、結核抗體和精制結核菌素試驗(PPD)等檢測項目,其中痰涂片抗酸桿菌陽性率2007—2008年僅為23%左右,而傳統(tǒng)的結核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)因靈敏度低,檢測周期長等原因,臨床未作為常規(guī)檢測項目,因此尋找一種準確快速可靠的診斷結核的方法十分迫切。

最近幾年,一些國家和地區(qū)以及我國的上海等地已經(jīng)將酶聯(lián)免疫斑點技術(ELISPOT)用于結核病的診斷,相關報道日益增多。結核分枝桿菌感染T淋巴細胞斑點試驗(T-Spot.TB)是由ELISPOT發(fā)展而來,為考察此技術在我院的應用情況,特進行下列試驗,現(xiàn)將結果報道如下。

材料與方法

一、研究對象

確診結核組[以痰涂片抗酸桿菌和(或)結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為標準]30例,其中23例肺結核,7例肺外結核,年齡1～65歲。男 21例,女 9例。其中結核住院患者23例,HIV合并結核感染7例。懷疑結核組53例,該組患者臨床及影像學疑似結核,但痰涂片抗酸桿菌及結核分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性。53例中44例疑似肺結核,9例疑似肺外結核。年齡19～80歲,男35例,女 18例。其中 24例為HIV感染者。正常對照組32名,其中健康體檢者28名,余4例為排除結核感染的呼吸道感染住院患者。年齡22～61歲,男8名,女24名。

二、儀器和試劑

Baker生物安全柜,RIVCO CO2孵育箱。TSpot.TB試劑盒(英國牛津Immunotec生產(chǎn)),淋巴細胞分離液、AIMV、RPMI1640由上海長征復星公司提供。

三、原理和方法

(一)原理 T-Spot.TB技術是利用結核分枝桿菌感染外周血單個核細胞(PBMC)中存在結核特異性T細胞,這些T淋巴細胞在受到結核分枝桿菌特異抗原刺激后分泌IFN-γ。PBMC和結核特異的混合抗原A(ESAT-6)和混合抗原B(CFP-10)與對照試劑一起加入預包被干擾素抗體的微孔板進行培養(yǎng)孵育。當PBMC中存在特異性T細胞時,培養(yǎng)液中加入的結核分枝桿菌特異混合抗原多肽A和多肽B將刺激其分泌。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ捕獲,再次加入的堿性磷酸酶標記抗體與被捕獲的IFN-γ相結合,滯留在微孔板上,加入顯色底物溶液在反應部位形成不溶性色素沉著斑點。每1個斑點代表1個結核分枝桿菌致敏的T淋巴細胞,根據(jù)斑點數(shù)可以判斷體內是否存在針對結核分枝桿菌反應的效應T細胞,并可計數(shù)T細胞的數(shù)量。

(二)方法 ①采集4 mL外周血標本置于肝素鋰抗凝的試管中,立即混勻,在4 h內進行PBMC分離。②離心管中預先加入4 mL RPMI 1640液,將混勻的4 mL抗凝全血加入離心管中,混勻。③另一離心管中預先加入3 mL淋巴細胞分離液,將混勻的8 mL細胞懸液緩慢加入淋巴細胞分離液上方,1 600 g離心22 min,用加樣槍吸取白細胞層到15 mL離心管中。④再加入RPMI 1640至11 mL,600 g離心7 min,棄去上清液。⑤加入AIMV培養(yǎng)液至11 mL,350 g離心7 min,棄去上清液。⑥加入0.7 mL AIMV液,充分搖勻使細胞懸液混勻。吸取10 μ L細胞懸液于40 μ L錐蟲蘭染液中混勻,再吸取10 μ L加入細胞計數(shù)板上計數(shù)。

每份標本調整至每毫升250萬個PBMC。取出T-Spot.TB試劑盒內微孔板,根據(jù)標本量取出板條。1份標本需4個微孔板,陰性對照加AIMV,陽性對照加植物血凝素(試劑盒內提供),另外2個孔分別加入抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)各50 μ L,然后每孔分別加入 100 μ L細胞懸液(即含有250 000個PBMC的懸液)。將微孔板放入5%CO2孵箱中孵育16～20 h,用 pH6.8～7.2的 PBS液洗板。加入堿性磷酸酶標記的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50 μ L,2～8℃冰箱孵育1 h,再用PBS液洗板,最后每孔加入顯色液50 μ L。避光室溫靜置7 min,用蒸餾水沖洗后觀察結果。用放大鏡觀察記錄每個孔中的斑點。

(三)結果判定 依據(jù)試劑盒內所附判定標準進行,陰性斑點數(shù)為0～5個,抗原A和抗原B檢測孔計數(shù)-陰性孔計數(shù)≥6判為陽性。如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6,檢測孔斑點數(shù)≥2倍陰性孔斑點數(shù)判為陽性。

結 果

確診結核組：即痰涂片抗酸桿菌陽性或其他體液標本涂片陽性和(或)結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的病例。30個標本中,檢測結果陽性25例,檢測靈敏度為83.3%(25/30)。正常對照組：共檢測32例,檢測結果陽性6例,陰性26例,特異度為81.3%(26/32)。疑似結核組：該組患者臨床及影像學疑似結核,但涂片及培養(yǎng)均為陰性。本組病例53例,檢測陽性28例,陽性率為52.8%(28/53)。T-Spot.TB試驗結果分布見表1。

表1 T-Spot.TB實驗結果和治療效果的比較Table 1.Comparison between results of T-Spot TB and clinical outcome

對肺外結核的檢測結果：共有16例,入組的肺外結核包括結核性腦膜炎4例、結核性胸膜炎2例、腎結核1例、結核性腹膜炎4例、關節(jié)結核1例和淋巴結核4例,T-Spot.TB陽性13例,陽性率達81.2%。

討 論

在確診結核組中T-Spot.TB結果陰性者5例,有2例是在抗結核療程超過1個月后進行檢測。有報道指出效應T淋巴細胞存活期很短,一般在病原體消滅后就消失[4]。所以我們推測這2例患者可能是治療后患者特異的T細胞計數(shù)迅速降低,故 TSpot.TB檢測陰性。另有報道嚴重的肺結核抑制了外周血T淋巴細胞的反應,可能導致這些患者缺乏可以檢測到分泌IFN-γ的特異T細胞。

正常對照組中T-Spot.TB結果陽性的6例標本,其中4例的標本來自健康體檢者,均為我科工作人員,年齡25～35歲,平時工作中與結核患者及其標本均有接觸,接觸時間平均4年,屬高危人群。由于目前國際尚無結核隱性感染診斷的金標準,無法進行驗證和排除,這4名體檢者可能為隱性感染者,另2例均為腫瘤患者,他們是否也存在潛伏感染尚不能證實。

從表1中我們可以看出疑似結核組：①抗結核治療有效28例,其中19例T-Spot.TB結果陽性,與最后臨床診斷符合率是67.9%(19/28),即陽性預測值;9例T-Spot.TB結果為陰性,經(jīng)抗結核治療有效。值得注意的是9例中7例為HIV感染合并結核,他們在該試驗中的低反應性可能是由于HIV相關的CD4細胞減少所致,由于檢測病例太少,我們未做相關CD4計數(shù)的對比。贊比亞的一項研究表明,RD1基因產(chǎn)物ELTSpot實驗的陽性反應率在HIV感染者是降低的[5]。②19例進行抗感染對癥治療等措施,16例治愈好轉,其中12例 TSpot TB陰性,4例陽性,試驗陰性與臨床診斷排除結核者的符合率為75.0%(12/16),即陰性預測值;假陽性率為25.0%(4/16)。假陽性的4例中有1例是陳舊性結核,現(xiàn)在是以十二指腸炎住院,對癥治療后出院,該例患者不能排除其體內還存在結核分枝桿菌,另外4例中有3例PPD陽性,他們有可能為潛伏感染者。

在實際觀察中,T-Spot.TB檢測的靈敏度83.3%,特異度為81.3%。這2個數(shù)據(jù)均低于國內外的相關報道[3-6]。分析其靈敏度較低可能因為TSpot.TB是基于免疫反應,納入確診結核組中有部分HIV感染患者,其免疫力低下所致;特異度觀察中,我們納入了與結核病有密切接觸者,可能存在潛伏感染而降低了特異度?，F(xiàn)在我國的現(xiàn)狀結核病的診斷率不足60%[3],PPD的靈敏度約為60%,但免疫低下患者陽性率僅為20%～30%,雖然該試驗操作方便、觀察結果容易,但靈敏度和特異度均不理想,曾經(jīng)有結核感染和接種卡介苗都可能出現(xiàn)假陽性,臨床診斷的意義不大;結核抗體檢查同樣存在特異性不高的情況,所以臨床懷疑結核而又無病原學資料時,T-Spot.TB試驗結果對臨床有指導價值,T-Spot.TB陽性者67.9%可能是結核(陽性預測值)。若T-Spot.TB試驗陰性,75.0%的概率可以排除結核感染(陰性預測值)。

綜合以上分析和國內外的一些研究,T-Spot.TB技術作為一種新的檢測結核感染的免疫學方法,它提高了結核檢測陽性率,可作為結核病早期診斷的一項輔助檢查手段,可用于臨床癥狀不典型、PPD診斷不明確和痰涂片培養(yǎng)均為陰性的疑似結核患者,此檢查方法具有較高的靈敏度和特異度,對肺外結核的診斷也很有價值。T-Spot.TB試驗采用外周血檢測,簡便易行,并且能快速出結果(第2天)。T-Spot.TB的應用不僅可使患者得到早期診斷,及時治療避免誤診,減少抗藥性,節(jié)省醫(yī)療費用;測定效應T淋巴細胞也可以反應機體是否清除了病原體,作為判斷治療是否有效的一項指標[4]。但T-Spot.TB檢測試劑盒價格昂貴,對低收入患者及地區(qū)有一定困難。

[1] Global tuberculosis control：surverllance,planning,financing.WHO report2005.GeneraWorld Health Organization(WHO/HTM/TB/2005.349).

[2] 全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志,2002,24(2)：65-108.

[3] 樂軍,梁莉,李蘇輝,等.酶聯(lián)免疫斑點試驗快速診斷結核分枝桿菌感染的臨床應用價值[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2006,29(11)：1005-1008.

[4] 史可云,胡忠義.酶聯(lián)免疫斑點技術在結核病診斷中的應用現(xiàn)狀[J].中華結核和呼吸雜志,2006,29(6)：414-416.

[5] Chapman A L,Munkanta M,Wilkinson KA,et al.Rapid detection of active and latent tuberculousis infection in HIVPositive indicicluals by enumeration of Mycobaterium tuberculosis-specific T cells[J].AIDS,2002,16(17)：2285-2293.

[6] Meier T,Eulenbruch HP,Wrighton-Smith P,et al.Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay(T Spot-TB)for diagnosis of tuberculosis in clinical practice[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2005,24(8)：529-536.