肖博 李揚(yáng) 付蘇 劉蓓 郭樹忠

嚴(yán)重?zé)齽?chuàng)傷后遺留的組織缺損較難修復(fù)，自體 組織移植后形態(tài)、功能均不佳。復(fù)合組織異體移植(composite tissue allotransplantation，CTA)是修復(fù)此類缺損的有效方式。CTA是包含多種組織類型的異基因移植。迄今，已有數(shù)十例手移植和十多例顏面移植成功應(yīng)用于臨床［1-4］，極大改善了患者的生活質(zhì)量。然而，復(fù)合組織一般包含諸如皮膚、肌肉、神經(jīng)、骨、軟骨、脂肪等多種組織成分，引起的宿主免疫排斥反應(yīng)復(fù)雜而強(qiáng)烈，需要的免疫抑制劑用量超過一般器官移植所需的量。長期、大量應(yīng)用免疫抑制劑后會對受者產(chǎn)生諸如抵抗力下降、臟器損傷、惡性腫瘤發(fā)生率增加等副作用，對機(jī)體損傷很大。因此，尋找能夠有效減少抗排斥反應(yīng)藥物用量的方法是CTA能否廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。異基因移植后排斥反應(yīng)在移植后早期很強(qiáng)，逐漸減弱，因此術(shù)后免疫抑制劑的用量也從大到小，形成階梯用藥。雷帕霉素是一種低毒的新型免疫抑制劑，我們應(yīng)用大鼠下腹部皮瓣異基因移植模型進(jìn)行雷帕霉素階梯用藥療效觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

雄性Lewis(RT11)和 Brown Norway(簡稱 BN，RT1n)近交系大鼠，8～l0周齡，體質(zhì)量0.20～0.25 kg。均購自北京Vital River公司，購買后由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心專業(yè)人員負(fù)責(zé)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為清潔級。雷帕霉素原藥購自華北制藥廠，用生理鹽水溶解制成質(zhì)量濃度為1 g/L溶液－20℃保存。

1.2 模型制作及分組

以BN鼠為供體，Lewis鼠為受體，以股動、靜脈為蒂進(jìn)行同種異體下腹部游離皮瓣移植。采用戊巴比妥鈉麻醉，劑量為50 mg/kg，腹腔注射給藥，術(shù)中必要時追加1/4量。手術(shù)過程簡述如下:在大鼠下腹部設(shè)計(jì)4 cm×4 cm大小皮瓣切取范圍。皮瓣的切割深度在腹肌肌膜表面。分離出腹壁淺動靜脈及股動靜脈，而后在腹壁淺動靜脈發(fā)出點(diǎn)遠(yuǎn)端結(jié)扎并剪斷大鼠股動靜脈，在大鼠腹股溝韌帶外切斷股動靜脈，皮瓣游離完成。相同范圍切除供體皮膚組織，小心解剖股動靜脈。供體股動靜脈和受體股動靜脈采用端端吻合。動靜脈吻合完成后，依層縫合肉膜和皮膚，移植手術(shù)完成。根據(jù)不同雷帕霉素用藥方案分為4組:Ⅰ 組(n=5)，不使用任何藥物;Ⅱ 組(n=5)，雷帕霉素 2 mg·kg－1·d－1;Ⅲ組(n=5)，雷帕霉素 4 mg·kg－1·d－1;Ⅳ組(n=8)，雷帕霉素術(shù)后1～2周 4 mg·kg－1·d－1，術(shù)后第 3 周改為2 mg·kg－1·d－1，第 4 周起 1 mg·kg－1·d－1。3 個給藥組均采取腹腔注射的方式給藥，用藥直至皮瓣發(fā)生排斥反應(yīng)壞死或至術(shù)后60 d(觀察終點(diǎn))。

1.3 大體觀察

術(shù)后每天觀察皮瓣變化，觀察的排斥反應(yīng)征象包括紅斑、皮膚質(zhì)地變硬、表皮脫屑和皮瓣發(fā)黑壞死。以皮瓣組織完全壞死記為排斥反應(yīng)終點(diǎn)。

1.4 組織病理學(xué)檢查

術(shù)后7 d對各組皮瓣組織進(jìn)行皮膚活組織檢查(以下簡稱活檢)，術(shù)后15、30 d對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組皮瓣組織進(jìn)行皮膚活檢，各組動物在每個時間點(diǎn)選取3只進(jìn)行取材活檢。取材方法為:給予動物半量麻醉，剪開一側(cè)皮瓣邊緣縫線，每次剪去1 cm×0.5 cm皮瓣組織，電凝止血后將皮瓣組織重新縫合于受體皮膚。所取組織用10%甲醛溶液固定，然后儲存于70%的乙醇中，切片，HE染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查。參考Banff 07標(biāo)準(zhǔn)［5］，對組織切片進(jìn)行病理學(xué)分級。0級，沒有或極少炎癥細(xì)胞浸潤;1級，輕微血管周圍炎，表皮不受累;2級，中等程度炎癥細(xì)胞浸潤，有或沒有表皮及皮膚附屬器受累［限于棘層細(xì)胞水腫或發(fā)生胞吐(exocytosis)現(xiàn)象］;3級，真皮層嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤，表皮受累包括表皮凋亡、角化不良、角質(zhì)溶解(keratolysis)等;4級，壞死性急性排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為表皮或皮膚其他結(jié)構(gòu)壞死。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

移植皮瓣存活數(shù)據(jù)制成Kaplan-Meier生存曲線，組間比較應(yīng)用對數(shù)秩檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植皮瓣存活情況和大體觀察

各組移植皮瓣存活曲線見圖1。

圖1 各組移植皮瓣存活情況

Ⅳ組與Ⅱ組移植皮瓣存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但Ⅳ組與Ⅲ組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

Ⅰ組排斥反應(yīng)進(jìn)展迅速，移植皮瓣排斥反應(yīng)過程表現(xiàn)為顏色逐漸蒼白，皮瓣腫脹逐漸加重，最終因微血管血栓、阻塞至皮瓣組織發(fā)黑壞死(見圖2A)。Ⅱ組給藥后皮瓣無明顯腫脹，顏色質(zhì)地正常。術(shù)后10 d左右出現(xiàn)表皮脫屑，繼而出現(xiàn)皮瓣發(fā)紅，質(zhì)地變硬，表皮脫落，直至皮瓣于術(shù)后16～20 d壞死(見圖2B)。Ⅲ組直至術(shù)后60 d，5例受體均未出現(xiàn)排斥反應(yīng)征象。Ⅳ組為階梯用藥組，除1例于術(shù)后30 d開始發(fā)生急性排斥反應(yīng)(見圖2C)，術(shù)后38 d皮瓣壞死外，其余7例直至觀察終點(diǎn)均未出現(xiàn)排斥反應(yīng)征象。Ⅲ組和Ⅳ組存活至觀察終點(diǎn)的受體移植皮瓣組織變化情況為:術(shù)后皮瓣無明顯腫脹過程，顏色正常，質(zhì)地柔軟;術(shù)后20 d左右開始，皮瓣表面毛發(fā)開始脫落，同時新的表皮組織形成;術(shù)后30 d左右，這一過程完成(見圖2D)，形成新的表皮組織。術(shù)后50 d左右，新的毛發(fā)開始長出。這些結(jié)果提示，持續(xù)應(yīng)用較小劑量的雷帕霉素(2 mg·kg－1·d－1)不能使移植物長期存活。當(dāng)藥量增加到 4 mg·kg－1·d－1后，移植物可獲得長期存活。而與大劑量(4 mg·kg－1·d－1)用藥方式相比，階梯用藥方式可以達(dá)到相同的抗排斥反應(yīng)效果。

2.2 皮瓣組織移植病理學(xué)變化

術(shù)后7 d，Ⅰ組組織鏡下可見真皮層大量單個核細(xì)胞浸潤，表皮細(xì)胞稍腫脹，依據(jù)Banff 07標(biāo)準(zhǔn)，評為3級(見圖2E，I);Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組皮膚組織未見異常，評為0級。術(shù)后15 d，Ⅱ組可見真皮層內(nèi)中等量的單個核細(xì)胞浸潤，毛囊周圍炎細(xì)胞浸潤，表皮未受累，評為2級(圖2F，J);Ⅲ、Ⅳ組皮膚組織未見異常，評為0級。術(shù)后30 d，Ⅳ組中有1例樣本組織真皮層有大量單個核細(xì)胞浸潤，真皮淺層可見帶狀炎細(xì)胞浸潤，表皮組織已被排斥，評為4級(見圖2G，K)，Ⅳ組其他樣本組織及Ⅲ組樣本皮膚組織未見異常，評為0級(見圖2H，L)。

圖2 各組發(fā)生排斥反應(yīng)病理學(xué)表現(xiàn)

3 討論

對含皮膚組織的異體復(fù)合組織移植排斥反應(yīng)的研究需要相應(yīng)的動物模型。大鼠因其大小適中，價格相對便宜，成為此類模型的主要動物之一。使用大鼠建立的CTA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀邢轮浦材Ｐ停?］、全/半側(cè)顏面移植模型等［7］。大鼠下腹部游離皮瓣包含了皮膚、肌肉、皮下脂肪等多種組織成分，其手術(shù)過程簡單，操作方便快捷，且包含CTA中免疫原性最強(qiáng)的皮膚組織，是研究CTA的良好模型［8］。我們選擇近交系BN和Lewis大鼠分別作為供體和受體，近交系動物是指通過持續(xù)20代以上的近親繁殖，基因已高度純合化的動物品系。應(yīng)用近交系動物可以使動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果正確、可靠、有規(guī)律性、重復(fù)性好，從而精確判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果、得出正確的結(jié)論。這些優(yōu)點(diǎn)在涉及免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中顯得更加重要。

雷帕霉素是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，通過阻斷IL-2受體信號，阻斷T淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞由G1期至S期的進(jìn)程，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。從目前臨床應(yīng)用來看，雷帕霉素是一種療效好、低毒和無腎毒性的新型免疫抑制劑。理論上雷帕霉素藥效是環(huán)孢素的40～100倍，同時它的腎毒性卻顯著降低［9］。移植后，雷帕霉素用量一般呈逐漸減少趨勢，即階梯用藥方案。這樣可以在保證移植物不被排斥的前提下減少藥物的副作用。在CTA后應(yīng)用雷帕霉素的階梯用藥方案尚未見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用雷帕霉素作單藥物階梯用藥治療。術(shù)后 4 周，藥物劑量維持在 1 mg·kg－1·d－1，除 1 例因排斥反應(yīng)皮瓣壞死外，其余受體均未發(fā)生排斥反應(yīng)。這一結(jié)果與大劑量持續(xù)給藥的方式相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了這一方案的有效性。

異基因移植后的組織和器官免疫抑制用藥分為誘導(dǎo)、維持、處理急性排斥反應(yīng)3個階段。誘導(dǎo)階段為移植后初期，這一時期發(fā)生的排斥反應(yīng)強(qiáng)烈。臨床上誘導(dǎo)階段用藥品種眾多，一般為他克莫司、嗎替麥考酚酯和潑尼松三聯(lián)用藥。在單藥物治療的動物模型中，誘導(dǎo)階段的用藥量較大。在大鼠顏面移植模型中，環(huán)孢素的用量為術(shù)后1周內(nèi)16 mg/kg，逐周遞減，從第4周起維持在2 mg/kg［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用雷帕霉素作單藥物治療，前兩周保持在4 mg/kg，第3周減半，第4周后維持在1 mg/kg，為初始用量的1/4，即可保持大多數(shù)(7/8)受體不發(fā)生急性排斥反應(yīng)。然而，相較于其他器官移植后的雷帕霉素用量(0.2 ～1.0 mg·kg－1·d－1)，1 mg·kg－1·d－1的藥物用量還是較高。其原因可能在于皮膚組織具有強(qiáng)抗原性［11］。可能的原因有:(1)皮膚組織中有特異性抗原呈遞細(xì)胞(朗格漢斯細(xì)胞)存在。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，皮膚組織中朗格漢斯細(xì)胞的密度與皮膚抗原性密切相關(guān)［12-16］。(2)皮膚組織特異性的結(jié)構(gòu)。真皮由膠原和氨基聚糖構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)包含了大量的淋巴黏附分子，因此可以聚集大量免疫反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素階梯用藥方案與較大劑量持續(xù)給藥相比，有相同的抑制排斥反應(yīng)效果，這一結(jié)果為應(yīng)用這一模型進(jìn)一步研究CTA的免疫抑制和免疫耐受奠定了基礎(chǔ)。

志謝第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院晏松齡教授在本研究病理學(xué)方面給予指導(dǎo)，謹(jǐn)致謝意

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