靳俊峰，劉愛軍，杜標炎

(1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東珠海 519041;2.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東廣州 510006)

組織工程皮膚是近年興起的一門新興學科，即利用來源于自體或異體的皮膚細胞，與適宜的真皮支架復合，在體外構建而成的皮膚類似物，將其移植入皮膚缺損創(chuàng)面，修復缺損的皮膚。皮膚缺損是臨床上的常見病與多發(fā)病，組織工程皮膚的問世為解決皮膚移植中的皮源不足問題提供了光明前景。但目前組織工程皮膚移植后存在血管化進程慢等問題，導致移植成功率低[1]，限制了其進一步的應用。

中醫(yī)學在治療皮膚創(chuàng)傷方面有著悠久的歷史，“生肌法”是其治療皮膚創(chuàng)傷的一項重要治則，生肌中藥通過“收斂止血、活血化瘀、祛腐生肌”等作用促進缺損皮膚的修復[1]。現(xiàn)代研究顯示，血管內皮細胞生長因子是最強的促血管再生因子[2]，本研究中我們將構建的組織工程皮膚移植后，利用經典方劑乳沒生肌散、“活血圣藥”龍血竭，對移植后的組織工程皮膚進行外敷和/或內服治療，觀察創(chuàng)面微環(huán)境中VEGF表達的變化，探討利用中藥的生肌作用促進組織工程皮膚移植后血管化進程的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

高糖-DMEM及低糖-DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津灝洋生物制品科技有限公司);25cm2塑料培養(yǎng)瓶(Coning公司);胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶(均為Sigma公司);其他試劑均為國產分析純。乳沒生肌散中各種藥材均購自廣州市杏園春大藥房;幼兒包皮取自中山一院兒外科無菌切除標本(病人家屬知情);人角質形成細胞購自中山大學北校區(qū)實驗動物中心;膠原海綿購自廣州市創(chuàng)爾生物技術有限公司。

1.2 動物

SPF級裸鼠，雌雄不拘，約20g，購自本校實驗動物中心，合格證號 SCXK粵2003-0001，粵監(jiān)證字2007A015。

1.3 免疫熒光試劑及儀器

Ⅰ抗血管內皮細胞生長因子VEGF(博士得生物試劑公司)，Ⅱ抗紅色熒光探針(Cy3)標記的山羊抗小鼠IgG(IgG-Cy3)及核標記物二脒基苯基吲哚(DAPI)(Sigma公司)。日本產IX71奧林巴斯倒置熒光顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 人皮膚細胞的培養(yǎng) 人角質形成細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)。幼兒包皮成纖維細胞由本實驗室分離、培養(yǎng)和鑒定[3]。

1.4.2 組織工程皮膚的構建 將無菌的膠原海綿剪成1cm×1cm×0.2cm小塊，放入無菌24孔板內，取3～5代人包皮成纖維細胞，按1×105個/cm2將細胞種植與于膠原海綿兩面，體積分數(shù)5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)3h～4h。將人角質形成細胞以1×105個/cm2密度接種于單面膠原海綿，無菌培養(yǎng)3～4h。

1.4.3 組織工程皮膚的移植 SPF級裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/Kg用藥)，固定于手術臺上，嚴格消毒后沿背部正中線左右距脊柱約0.5cm處皮膚呈“C”形切開，形成皮瓣，分離皮下組織至深筋膜暴露肌層，切口大小約1cm2。將體外構建的組織工程皮膚覆蓋到全層皮膚缺損的創(chuàng)面，再用無菌凡士林紗布覆蓋，單針縫線固定皮瓣與正常皮膚上，無菌紗布包扎。術后2d拆除敷料，剪掉皮瓣，單籠飼養(yǎng)。

1.4.4 分組 實驗動物隨機分為5組，每組4只，分為乳沒生肌散外敷組、龍血竭外敷組(隔日換藥)、龍血竭內服組、龍血竭外敷并內服組(70mg/kg/d灌胃)，不用藥者為空白對照組。術后9d取材檢測，單籠避光飼養(yǎng)。

1.4.5 HE染色及免疫熒光檢測 術后9d取材，連同周邊正常皮膚剪去少許，4℃、40g/L多聚甲醛(pH 7.4)固定6h～8h，300g/L蔗糖過夜，冰凍切片，片厚8μm，部分行蘇木素-伊紅(HE)染色，部分行VEGF抗體免疫熒光組織化學染色，Ⅰ抗?jié)舛葹?∶100，Ⅱ抗 IgG-Cy3濃度 1∶100。封片劑為甘油PBS(甘油∶PBS 為9∶1)。

免疫熒光組織化學染色步驟:冰凍切片，PBS(PBS 0.01M，pH=7.4)洗3遍。體積分數(shù)3%正常羊血清封閉，室溫30min，注意不用PBS洗。加I抗VEGF，4℃過夜后PBS洗3遍。加Ⅱ抗山羊抗小鼠IgG-Cy3，室溫下孵育1h，PBS洗3遍。DAPI復染核15min。甘油PBS封片，熒光顯微鏡觀察并拍片。

2 結果

2.1 移植處大體觀察

術后2d各組創(chuàng)面縮小，手術部位無紅腫、明顯收縮、膿性分泌物等，移植物黏附于創(chuàng)面，表面光滑較硬;術后9d移植處開始變軟，呈白色，表面光滑。

2.2 組織學檢測結果

正常裸鼠皮膚表皮較薄，表皮細胞深入真皮層中，形成毛囊樣、皮脂腺樣等皮膚附屬器，真皮結締組織較疏松，膠原纖維少(圖1)。組織工程皮膚移植后9d，對照組表皮細胞增生為多層，表皮較厚，部分區(qū)域與真皮連接不緊密，真皮較致密，膠原纖維增多，排列紊亂(圖2);乳沒生肌散治療組、龍血竭治療各組標本表皮亦增生較厚，表皮與真皮連接較均勻，真皮較致密，膠原纖維增多，排列方向較均勻一致，可見較多新生毛細血管(圖3、4)，尤以龍血竭外敷并內服組明顯(圖4);對照組及各實驗組標本均未見毛囊樣、皮脂腺樣等皮膚附屬器。

圖1 正常裸鼠皮膚，表皮較薄，真皮結締組織疏松，含較多毛囊樣、皮脂腺樣結構(×200)圖2 對照組組織工程皮膚移植處9d，表皮增厚，表皮與真皮連接欠佳，真皮致密，膠原纖維排列紊亂(×200)圖3 乳沒生肌散組，表皮較厚，表皮與真皮連接緊密，結締組織致密，膠原纖維排列整齊，毛細血管增生(×200)圖4 龍血竭外敷并內服組，表皮與真皮結構同乳沒生肌散組，毛細血管增生明顯(×200)

2.3 免疫熒光檢測結果

組織工程皮膚移植后9d，對照組標本表皮及真皮有少數(shù)VEGF表達陽性細胞(圖5)，乳沒生肌散治療組及龍血竭治療各組表皮可見明顯的VEGF表達陽性細胞，真皮中亦有VEGF表達陽性細胞，其中龍血竭外敷并內服組VEGF表達陽性細胞多于其他各組(圖6～9)。

圖5 組織工程皮膚移植后9d，對照組表皮(圖5a)和真皮(圖5b)中均有少數(shù)VEGF陽性細胞(圖5A、5B)(×200)

圖6 組織工程皮膚移植后9d，乳沒生肌散外敷組表皮和真皮(圖6a)中VEGF陽性產物(圖6A)增多增強(×200)圖7 組織工程皮膚移植后9d，龍血竭外敷組表皮和真皮(圖7a)中VEGF陽性(圖7A)產物增多增強(×200)

圖8 組織工程皮膚移植后9d，龍血竭內服組表皮(圖8a)和真皮(圖8b)中VEGF陽性(圖8A、8B)產物增多增強(×200)

圖9 組織工程皮膚移植后9d，龍血竭外敷并內服組表皮(圖9a)和真皮(圖9b)中VEGF陽性(圖9A、9B)產物明顯增多增強(×200)

3 討論

組織工程皮膚是修復大面積皮膚缺損的最佳選擇，并且在治療瘢痕攣縮及整形美容等領域都有重要的應用價值[4]。組織工程皮膚移植后血管化進程慢而導致移植成功率低是限制組織工程皮膚進一步應用的一個主要原因[5]。“生肌法”是中醫(yī)學在醫(yī)療實踐中形成的重要治則，時至今日仍顯示出獨特的優(yōu)勢。中醫(yī)所講的“肌”包括皮膚、黏膜、肌肉、神經、血管、骨等組織?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，皮膚缺損修復主要包括肉芽組織增生、血管長入及上皮組織增生重新覆蓋創(chuàng)面等過程，“生肌”就是促進這個過程的完成[6]。

VEGF是目前公認的最強的促血管再生因子，利用生肌中藥作用于移植后的組織工程皮膚能否促進VEGF的表達、能否促進毛細血管再生，進而促進皮膚創(chuàng)面的修復是本研究的主要內容。乳沒生肌散是中醫(yī)藥治療皮膚損傷的經典方劑，據(jù)《古方匯精》所載，該方劑中含生乳香、生沒藥、血竭、紅升、麝香、冰片等。其中乳香、沒藥、血竭為重要的活血化瘀藥，具有活血行氣止痛、活血消癰、去腐生肌的功效，為外傷科要藥[7]。研究亦證實，乳沒生肌散作用于移植后的組織工程皮膚，在早期能促進VEGF的表達，促進毛細血管的再生。由于乳沒生肌散中各種成分復雜，真正的有效成分及確切的作用機制仍未完全明了，所以本研究又再此基礎上探討了被譽為“活血圣藥”龍血竭對組織工程皮膚移植后的作用。實驗結果顯示，龍血竭亦能促進組織工程皮膚移植后VEGF的表達，毛細血管增生明顯，以龍血竭外敷并內服治療組效果最佳。本研究結果強烈提示，生肌中藥作用于移植后的組織工程皮膚能增強VEGF的分泌，促進毛細血管再生，有利于促進組織工程皮膚修復皮膚缺損。

[1]易成剛，郭樹忠，陳建宗.生肌類中藥的理論與實驗研究[J]. 中國臨床康復，2004，8(29):6470-6471.

[2]Simons M.Integrative signaling in angiogenesis[J].Mol Cell Biochem，2004，264(1-2):99-102.

[3]劉愛軍，靳俊峰.人皮膚成纖維細胞的高效分離培養(yǎng)及鑒定[J]. 廣東醫(yī)學，2008，29(12):1969-1970.

[4]Hu S，Kirsner RS，F(xiàn)alanga V，et al.Evaluation of Apligraf persistence and basement membrane restoration in donor site wounds:a pilot study[J].Wound Repair Regen，2006，14(4):427-433.

[5]Anthony D.Metcalfe and Mark WJ.Ferguson.Bioengineering skin using mechanisms ofregeneration and repair[J].Biomaterials.2007，28(34):5100-5113.

[6]范吾鳳，閻偉，公潔.有關促進創(chuàng)面愈合的外用中藥的研究進展[J].中醫(yī)外治雜志，2003，12(6):36-37.

[7]沈映君主編.中藥藥理學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000.655-657.