肖麗丹 余 輝 胡朝穎 蔡 華 劉清君 王 平

(浙江大學 生物傳感器國家專業(yè)實驗室，生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，生物醫(yī)學工程系，杭州 310027)

引言

隨著微加工工藝的發(fā)展，細胞傳感器和芯片的結合已經(jīng)越來越緊密，以細胞作為一級傳感器，芯片二級傳感，能檢測外界環(huán)境變化對細胞的影響，因此可應用于細胞學研究、藥物篩選、藥效評估、環(huán)境監(jiān)測、臨床疾病診斷等多個領域。目前比較常用的細胞傳感器主要有胞外電位檢測類器件如微電極(microelectrode arrays，MEA)［1］和場效應管(field effect transistor，F(xiàn)ET)［2］、阻抗傳感器(electric cellsubstrate impedance sensing，ECIS)［3］、微 生 理計等［4］。

雖然這些細胞傳感器已經(jīng)有了廣泛的應用，但是在細胞生理實驗時，大多數(shù)都只能檢測細胞某一方面的生理活動，而忽略或者無法同時檢測細胞其他功能或結構的變化，減少了信息獲取。因此，本實驗室在累積了以前工作經(jīng)驗的基礎上，設計了一種集成 ECIS、MEA、光尋址電位傳感器(lightaddressable potentiometric sensor，LAPS)三種傳感器的新型細胞多功能參數(shù)檢測的集成芯片。此設計能同時對細胞生長狀態(tài)及細胞胞外電場、離子代謝等功能等進行實時檢測，也可選擇性地對細胞某兩方面的參數(shù)進行同步監(jiān)測，并能對電興奮和非電興奮細胞都可研究，增加了實驗的靈活性和應用的廣泛性。

ECIS系統(tǒng)是檢測細胞在電極表面的貼附、遷移等引起的細胞-電極貼附阻抗的變化，一般用交流阻抗譜來表征。叉指電極(interdigited electrodes，IDE)能對細胞群體的阻抗進行檢測，因此本設計中ECIS功能模塊電極采用了IDE，主要用于對在不同條件中細胞狀態(tài)的實時監(jiān)測。

MEA是制作在絕緣基底上，大小和細胞相匹配的金屬薄片圓盤陣列，直徑一般為幾十微米，每個獨立圓盤有獨立引線引出和外界系統(tǒng)相連。當具有電興奮性的細胞培養(yǎng)于其上時，能感應胞外動作電位的變化，并輸出至外部系統(tǒng)以供分析。通常平面型MEA具有夾層結構，即導電的金屬薄層置于兩絕緣層間(底層為玻璃基底或生長了SiO2的硅基底，上層為氧化硅或氮化硅保護層)，同時和細胞接觸用于傳感的金屬薄層位點暴露。

LAPS為一種光尋址細胞微生理計，當表面沉積不同的離子選擇性膜時，可對相應離子的濃度進行檢測，如H+，Na+，K+等。它的基本原理是半導體的內光電效應，即當半導體受到一定波長的光照射時，半導體吸收光子發(fā)生禁帶到導帶的躍遷，產(chǎn)生電子空穴對。給LAPS外加反向偏置電壓時，半導體中產(chǎn)生耗盡層，這時靠近耗盡層的電子空穴對就被耗盡層拉開，當調制光強時 ，就會產(chǎn)生光生電壓。此時，外界微小的偏壓(如細胞表面微環(huán)境電壓或離子流變化)就會產(chǎn)生一個微小的信號。

文中將對集成芯片的設計、加工流程及器件的性能進行分析討論，并進一步討論其潛在應用。

1 集成芯片設計及制作

1.1 集成芯片設計

整個集成芯片由三部分組成:叉指電極、微電極陣列、光尋址電位傳感器。芯片各部分的布局如圖1所示。整個芯片面積為17.7 mm×17.7 mm。各功能模塊在集成芯片中呈對稱分布，MEA為上下兩組，LAPS分布于芯片四角，IDE則分布于芯片中心左右兩組。芯片各模塊共享參考電極，并將三部分在空間上進行接地隔離，同時用作LAPS區(qū)域標記。表1為各部分參數(shù)，其中MEA電極位點為圓形，直徑為 25 μm，和通常心肌細胞大小 10～30 μm大小相匹配，相鄰電極間距為200 μm，減小了相鄰電極之間的電場干擾。LAPS的面積不能過小亦不能過大，這是由于LAPS部分需在背面濕法刻蝕減薄硅片，刻蝕有一定角度，因此設計面積過小會使刻蝕后區(qū)域不夠;而減薄后面積太大則會使硅片易碎，給加工帶來風險。在 IDE設計中，當電極寬度減小時，每根電極的阻抗就會增大，從而沿著單根電極會形成電勢差，細胞貼附在不同位置對總阻抗的貢獻會不同，這種情況是不希望出現(xiàn)的。因此電極寬度不宜過小，長度不宜過長，使靈敏度和有效細胞數(shù)目達到較好的平衡。

圖1 集成芯片的設計圖Fig.1 The layout of the integrated chip

1.2 集成芯片加工

在加工工藝中，MEA和IDE都采用金電極且基底結構和保護層結構均一樣，因此可共享加工工藝。而LAPS無金電極且其各絕緣層厚度和MEA、IDE不一致，所以需要在加工中將兩部分工藝融合。具體的加工工藝流程見圖2。加工過程主要分成5個階段，這些階段中包括了圖2所示的11個步驟。

表1 集成芯片各模塊參數(shù)Tab.1 Parameters of the designed integrated chip

1)LAPS區(qū)域背面減薄。芯片以硅為基底，厚度為430 μm。在清洗以后首先硅片背面 LAPS對應區(qū)域減薄，刻蝕時用光刻膠將之外的區(qū)域用光刻膠作保護。背面減薄后可以減輕光強衰減對LAPS的影響。(步驟1和步驟2)

2)LAPS表面絕緣層生長及沉積。背面減薄后的硅片接著熱生長一層50 nm的SiO2，并使用化學氣相沉積(PECVD)工藝在其上面沉積一層100 nm的Si3N4。用光刻膠保護，將LAPS表面之外的區(qū)域SiO2和Si3N4刻蝕。(步驟3和步驟4)

3)保護 LAPS的同時加工 MEA及 IDE。為避免影響MEA和IDE部分加工對LAPS的影響，LAPS部分需被保護。在前幾步加工的基礎上，芯片上采用PECVD沉積一層厚度為600 nm的SiO2層，既用于硅片和金屬層之間的絕緣，也用于對LAPS表面的保護。金屬層采用Au/Ti復合層，Ti用于增強金和沉積了SiO2的硅基底之間的黏合度。接著用光刻膠保護，刻蝕出 MEA＆IDE的電極和引線圖案。由于引線部分需要和外界絕緣隔離，因此800 nm厚的Si3N4沉積其上，并用光刻膠保護將電極電位和焊盤暴露。(步驟5～步驟9)

4)去保護露出 LAPS。在 Si3N4保護層刻蝕后并在光刻膠去除之前，將正面和背面用于保護LAPS部分的 SiO2層刻蝕，此時 MEA、IDE、LAPS三部分的基本工藝完成。(步驟10)

5)硅片背面LAPS區(qū)域處濺射 Al層。LAPS部分的信號在硅片背面輸出，用光刻膠保護在減薄部分外的區(qū)域濺射鋁層，用作歐姆接觸。(步驟11)

圖2 集成芯片加工工藝過程流程圖Fig.2 The fabrication proceeds of the integrated chip

1.3 集成芯片封裝

為將芯片檢測到的信號輸出至外部系統(tǒng)，芯片中MEA和IDE電極位點對應的裸露焊盤和PCB板上的對應焊盤用金線鍵合。而LAPS則通過芯片背面將信號輸出，因此在PCB板和芯片接觸處裸露出金盤，并用導電膠將芯片背面的鍍鋁層黏合來實現(xiàn)導電。在歐姆接觸完成后，用環(huán)氧樹脂將所有接觸處封合，避免受到溶液干擾或腐蝕。芯片和PCB封合后，用一直徑為2 cm的有機玻璃圓環(huán)并用環(huán)氧樹脂將芯片封裝，用作細胞培養(yǎng)腔。PCB板的信號則通過單排插針輸出到外部系統(tǒng)的前置放大器處。圖3為封裝后的芯片實物圖。

圖3 封裝后的芯片實物圖Fig.3 The picture of the packaged device

1.4 集成芯片測試

在完成芯片設計、加工、封裝后，對集成芯片各模塊性能進行了測試、評估。

圖4為集成芯片各模塊的電學測試結果。在測試中，集成芯片腔體中注入pH為7.4的PBS溶液，并且放入有法拉第屏蔽箱的培養(yǎng)箱中檢測，模擬細胞生長環(huán)境的同時也避免了外界電磁干擾。

由于IDE是阻抗傳感器，采用交流阻抗譜進行了測試。圖4(a)為IDE的交流阻抗譜測試結果。在頻段103～104.5Hz內，阻抗幅度值成近似線性，相位近似為一恒定值，因此主要呈容性;在頻率范圍104.5～106Hz時，阻抗幅度值降低，相位值下降，此時阻抗譜變化由容性和阻性共同引起。因此頻率范圍104.5～106Hz更適宜檢測細胞阻抗，且對細胞貼附過程的表征具有較好的靈敏度。

為保證MEA能檢測細胞的胞外電位，各通道電極需具有較小的阻抗，從而減小因為阻抗引起的熱噪聲。通常，在頻率1 KHz時阻抗值低于100 KΩz時，噪聲值能較穩(wěn)定。類似IDE的測試方法，微電極掃描得到的阻抗幅度如圖4(b)所示。在1 KHz時，阻抗值為600 KΩ，引起的噪聲幅度達20 μV以上，其基線漂移嚴重。為了能將噪聲幅度減小，在工藝基礎上，對微電極表面做了電鍍鉑黑處理，在電極表面附著上“棉絮”狀的納米級鉑黑顆粒，使電極的比表面積增大，從而降低阻抗［5］。電鍍后，在1 KHz時，阻抗降為7 KΩ，噪聲基線幅度能減小至(14±2)μV，基線平穩(wěn)，滿足信號檢測要求。

LAPS利用背面 LED照射，頻率為6 KHz時偏壓-光生電流曲線如圖4(c)所示。線性區(qū)和飽和區(qū)明顯，從圖中可以看出，所制備的芯片的線性區(qū)范圍大約為－600 mV～150 mV，線性度較高。

由于此集成芯片主要用于離體培養(yǎng)細胞的生理參數(shù)檢測，因此芯片需和細胞之間具有生物相容性。為測試芯片的相容性，在芯片上培養(yǎng)了心肌細胞系HL-1。首先，將芯片在75%的酒精和去離子溶液中輪流沖洗，為保護芯片的結構，動作宜輕，直至在顯微鏡上觀察芯片表面清潔為止。清洗后的芯片在高溫消毒或紫外曝光后，表面涂布明膠，進行HL-1培養(yǎng)，具體培養(yǎng)方法可參考文獻［6］。培養(yǎng)3 d后，細胞伸展貼附于芯片上，且出現(xiàn)了一致性搏動，證明了芯片具有良好的細胞相容性。

2 討論

本研究中，為了能同步對細胞的生長狀態(tài)、細胞生理功能(如電位、離子代謝)等進行同步檢測，3種功能類型的器件 IDE、MEA、LAPS集成加工在同一硅基底芯片上，且保證了對同一批次培養(yǎng)的細胞進行不同角度的研究。

在設計中，保證了各部分功能的多通道檢測;各功能模塊對稱分布，有利于減少芯片上細胞的分布不均性而帶來的數(shù)據(jù)偏差;在加工時，由于模塊之間的結構差異，因此采取了 LAPS-MEA＆IDELAPS的加工順序，有機地將3種功能傳感器加工在同一硅基底上;加工封裝后的器件在測試結果中證明，其電學特性上滿足了細胞各功能檢測的指標，并實驗證明了芯片具有良好的生物相容性。

因此本芯片可運用于細胞生理參數(shù)的實驗，并能長期、無損地對細胞生理狀態(tài)、功能進行實時跟進并綜合分析。但是在實驗過程中，三部分功能傳感器之間的協(xié)調仍需進一步研究，并應根據(jù)所檢測細胞對象不同、所設計實驗的不同而進行適當改進，以獲取最佳實驗結果。

圖4 各部分的性能測試結果。(a)IDE電極的交流阻抗譜;(b)MEA中微電極在電鍍鉑黑前后的阻抗變化;(c)LAPS的偏壓-光生電流曲線Fig.4 The test results of the integrated chip.(a)impedance spectroscopy of the IDE;(b)the impedance of amicroelectrodein MEA beforeand afterthe electroplation ofplatinum black;(c)biasvoltagephotocurrent curve of LAPS

3 結論

由于集成芯片的功能全面性，在應用方面可對細胞基本的生理特性進行研究如細胞黏附、遷移過程中的功能性參數(shù)變化?？蓪Ψ请娕d奮性細胞的生長狀態(tài)和離子代謝進行結合分析，亦可對電興奮性細胞生長、遷移過程中狀態(tài)變化和電生理活動之間的關系，和對細胞的生長過程進行定量分析。

在藥物對細胞作用后，可對細胞在藥物作用時候的狀態(tài)遷移變化和功能缺失方面作同步研究。例如，當前心臟病依舊是威脅人類生命與健康的一大類疾病，研究各種心臟病類藥物對心臟的作用，非心臟類藥物對心臟的毒性是心臟藥物篩選的兩大課題。用集成芯片對心肌細胞進行監(jiān)測時，動作電位幅度、頻率、阻抗的幅值、相位，及胞外各種離子如H+，Na+，K+等濃度變化，有助于建立一個全面的評價系統(tǒng)，并可通過模式識別、主成分分析等方法對藥物的藥效或毒性進行定量分析。

另一方面，集成芯片也可用于對神經(jīng)網(wǎng)絡的研究。如神經(jīng)毒素對神經(jīng)網(wǎng)絡傳輸、編碼等的影響。如可用于對嗅覺、味覺細胞在不同氣體或味道的刺激下，對其動作電位發(fā)放編碼、胞外微環(huán)境離子代謝等進行同步檢測，探索嗅覺、味覺系統(tǒng)的機理，進一步推動人工嗅覺、味覺系統(tǒng)的發(fā)展。

［1］Kovacs GTA.Electronic sensors with living cellular components［J］.Proceedings of the IEEE，2003，91(6):915－929.

［2］Ingebrandt S， Yeung Chi-kong， Krause M， et al.Cardiomyocyte-transistor-hybrids for sensor application ［J］，Biosens Bioelectron，2001，16(7－8):565－570.

［3］Keese CR and Giaever I.A Biosensor that Monitors Cell Morphology with Electrical Fields ［J］，IEEE Eng Med Biol，1994，13(3):402－408.

［4］余輝，蔡華，徐瑩，等.基于多種敏感膜的多參數(shù)細胞微生理計研究［J］，微納電子技術，2007，44(7－8):1671－4776.

［5］IlicB，CzaplewskiD，NeuzilP， etal. Preparation and Characterization of Platinum Black Electrodes［J］，J Mater Sci，2000，35(14):3447－3450.

［6］Claycomb WC，Lanson NA Jr，Stallworth BS，et al.HL-1 cells:a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(6):2979－2984.