王莊，李曾夏子，李文平，趙琴

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

蚯蚓通常生活在充滿大量致病微生物的環(huán)境,但卻極少患病，因其具有經(jīng)過長期進(jìn)化而形成的抵抗外來微生物侵襲的機(jī)制.人們采用現(xiàn)代生物技術(shù)從蚯蚓中分離到了多種生物活性成分，如抗菌肽、纖溶酶、纖溶酶原激活劑、抗氧化酶系、免疫球蛋白和抗腫瘤成分等[1].其中抗菌肽是具有抗菌作用的多肽，它們是生物體的非特異天然防御屏障[2]，大量研究表明，它對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、癌細(xì)胞、病毒、原蟲具有廣泛的殺傷活性和高效性[3-4]，與傳統(tǒng)的抗生素相比，具有分子量小、廣譜抗菌、熱穩(wěn)定性好、抗菌機(jī)理獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn).但不同的抗菌肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌的作用有所不同[5-6].如Milochau從蚯蚓體液中分離到了兩種分子量為40 kD和45 kD、具有抗菌、溶血和凝血功能的蛋白質(zhì)，命名為Fetidins；Chao等從蚯蚓Lumbricus rubellus中分離到了抗菌肽LumbricusⅠ,體外試驗表明其具有廣譜的抗菌活性；Dhainaut等從蚯蚓體腔G1粒細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種能夠抑制大腸桿菌和微球菌的金屬抗菌蛋白(MPⅡ)，表明免疫后的蚯蚓抗菌活性物質(zhì)增加明顯[7-9].但30 kD以下的抗菌肽的分離提取少見報道.筆者對3~30 kD蚯蚓抗菌肽進(jìn)行分離純化，并研究其抑菌效果.

1 材料與方法

1.1 材料

人工養(yǎng)殖的大平2號蚯蚓.

主要儀器：高速低溫離心機(jī)、冷凍干燥機(jī)、凝膠過濾層析系統(tǒng)、電泳儀、酶標(biāo)儀、組織勻漿機(jī)等.

試劑： SP-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-50 Medium、Tris、過硫酸銨、TEMED、Tricine、SDS、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、小分子Protein Marker等.

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓抗菌肽的誘導(dǎo)及其蚯蚓初提物的制備

新鮮蚯蚓以pH6.8磷酸鹽緩沖液 (PB)為緩沖體系，5V、30 s/1.5 min進(jìn)行電擊誘導(dǎo)[10],勻漿，將提取液用高速冷凍離心機(jī)4℃、10 000 r/min，離心30 min，取上清液-20℃保存.

1.2.2 3～30 kD蚯蚓抗菌肽的分離純化

①超濾管截留3~30 kD的蚯蚓抗菌肽 (超濾有濃縮和脫鹽作用)采用30 kDMillipore和3 kDMillipore超濾離心管分別對制備的初提液進(jìn)行截留處理，在5 000g/min下離心30 min，-4℃冰箱保存，備用.

②陽離子交換分離.將SP-Sepharose Fast Flow纖維素以“酸-堿-酸”處理后，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑，放入0.01mol/L pH5.45乙酸銨緩沖液中平衡后裝柱.加入樣品，用220 mL 0.05~1mL的乙酸銨緩沖液梯度洗脫分管收集，在280 nm處測其光密度，并測定各峰的抑菌活性.

③凝膠過濾層析[11].用Sephadex G-50 Medium進(jìn)行凝膠過柱，按凝膠體柱長的1%～5%加入樣品量，用0.01 mol/L pH5.45乙酸銨緩沖液洗脫，在280 nm波長下檢測收集液的峰值并收集，樣品濃縮后檢測抑菌活性，并放入-20℃冰箱保存.

1.2.3 蛋白濃度和相對的質(zhì)量的測定

①考馬斯亮藍(lán)測定蛋白濃度[12].將牛血清蛋白原液 (1 mg/mL)稀釋成11個不同梯度濃度的溶液，分別測定其在280 nm的紫外吸收光值，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線.取適量的待測樣品，在280 nm處測得其吸收光值，得出數(shù)值后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對應(yīng)的濃度.

②TricineSDS-PAGE電泳觀察抗菌肽分子量[13].凝膠的灌制參照濃縮膠：3%C丙烯酰胺儲存液配成4%的丙烯酰胺溶液聚合而成；夾層膠：3%C丙烯酰胺儲存液配成10%的丙烯酰胺溶液聚合而成;致密膠：6%C丙烯酰胺儲存液配成16.5%的丙烯酰胺溶液聚合而成.加入樣品和mark后，30 V 1 h后調(diào)至100V至電泳結(jié)束，剝離膠固定，脫色、拍片.

1.2.4 蚯蚓抗菌肽抑菌的活性測定

用無菌的96孔微量板，將過濾除菌的抗菌肽H1、H2溶液10 μL依次加入各種接種好菌種的100 μL培養(yǎng)基中，再加入菌液10 μL，每一組做3個平行實(shí)驗組，最終結(jié)果取平均值，以肉湯培養(yǎng)基為空白對照，測得各孔的OD值與37℃培養(yǎng)24 h后的孔OD值進(jìn)行比較，算得平均值，觀察抑菌活性.

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

2.1.1 陽離子交換分離情況

新鮮蚯蚓經(jīng)電擊誘導(dǎo)，充分釋放肽類物質(zhì)，超濾濃縮脫鹽后，再經(jīng)過SP-Sepharose Fast Flow纖維素陽離子交換的方法進(jìn)一步純化，去除較多雜蛋白.結(jié)果如圖1所示，在3~4管有一個小的吸收峰，而在5~7管有一個很顯著的吸收峰，經(jīng)過進(jìn)一步的抑菌活性檢測后，發(fā)現(xiàn)第5~7管有抑菌活性，其他管無明顯的抑菌活性.

2.1.2 Sephadex G~50 Medium柱層析結(jié)果

合并5~7管的蛋白物質(zhì)經(jīng)Sebhaadex G-100層析柱提純后的，得到了兩個明顯的洗脫峰 （圖2），分別為1-3管、5~7管，合并吸收峰值相同的管，編號為H1、H2.

圖1 蚯蚓粗提物在SP-SepharoseFastFlow上的分離結(jié)果Fig.1 Iorn exchange chromatograohy on SP-Sepharose Fast Flow of the earthworms ABPs extract

圖2 蚯蚓抗菌肽在Sephadex G-50中的分離結(jié)果Fig.2 Gel chromatography on Sephadex G-50 of earthworms ABPs

2.2 蛋白濃度和分子量的測定結(jié)果

經(jīng)考馬斯亮藍(lán)測定，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上比對，得出H1及H2抗菌肽的質(zhì)量濃度分別為6.82 mg/μL、 7.46 mg/μL.

用H1和H2的Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果與小分子蛋白Marker進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)H1、H2兩種抗菌肽的相對分子質(zhì)量分別在5 856～7 823和2010左右(圖3).

圖3 蚯蚓抗菌肽Tricine SDS-Page電泳結(jié)果Fig.3 Earthworms ABPs Tricine SDS-Page electrophoresis

2.3 蚯蚓抗菌肽的抑菌活性

觀察培養(yǎng)前后，酶標(biāo)儀測定的OD變化平均值，確定其抑菌效果見表1.

表1 各種細(xì)菌培養(yǎng)前后OD平均值變化Table 1 Before and after the change of OD value of culturing various kinds of bacterial

3 討論

抗菌肽 (AMPs)作為生物體抵御外源微生物入侵的第一道防線，廣泛存在于各類群的動物體內(nèi).天然的抗菌肽通常是由30多個氨基酸殘基組成的堿性小分子，多肽分子量一般在50 kD以下，表現(xiàn)出較強(qiáng)的陽離子特性[14].人們發(fā)現(xiàn)不同抗菌肽具有不同的活性，如Ekengren等從果蠅中提取的名為ecropin的抗菌肽，對試驗用真菌的致死濃度為0.4~4.0 μmol/L；Shallabuddin研究也發(fā)現(xiàn)昆蟲抗菌肽對感染蚊子的瘧原蟲發(fā)育的不同時期有不同的作用.程碌俠等從家蠅蛹中分離到了抗弓形蟲的抗菌肽；韓立軍從蚯蚓中分離出的抗菌肽初提物體外對小鼠脾淋巴細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)作用，并且對S-180腫瘤也有明顯的抑制作用[15-17].

通過超濾、陽離子交換、層析過柱分離到了兩個峰值的抗菌肽H1和H2，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)測得發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)量濃度分別為6.82、7.46 mg/μL；經(jīng)Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得其分子量在5 856~7 823和2010左右.這與夏先琳研究結(jié)果類似[18].并且可以看出過柱后抗菌肽H1的純度較H2高，因為在電泳凝膠上抗菌肽H1僅有一個明顯亮帶而H2除了接近于20.1 kD的最明顯亮帶外，還有14.4的亮帶，純度較低.

抗菌肽的主要作用是抵抗外來微生物，對細(xì)菌，真菌，病毒都有廣泛的殺傷活性.分子量的大小與其的抗菌活性有密切的關(guān)系，一般來說分子量越小其抑菌活性越高，如韓立軍因9倍的丙酮體積提取出相對分子質(zhì)量約為3 313~7 823的抗菌肽，對大腸桿菌的抑菌效果要明顯高于對金黃色葡萄球菌和變形桿菌的抑菌效果.而分別用6倍和3倍體積丙酮所提取的分子量更大的多肽的抑菌效果較差[17].

本實(shí)驗所提取的3~30 kD的抗菌肽分子通過抑菌試驗顯示H1對巴氏桿菌、大腸桿菌、草枯桿菌、金黃色葡萄球菌都有較好的抑菌效果，而H2對巴氏桿菌、大腸桿菌、草枯桿菌效果較好，對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌效果～較弱.這與張希春等人在2002年的研究結(jié)果類似[19].對于同一種細(xì)菌來說，H1和H2的效果也有所不同，H1的抑菌效果比H2的明顯.可見30kD以下的抗菌肽的抑菌效果因分子量的不同而變化.

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