謝彥海，胡寶慶，文春根*

(南昌大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，江西 南昌 330031)

目前，貝類免疫學(xué)研究主要集中在對(duì)其血細(xì)胞的分類及作用等方面[1].關(guān)于貝類血細(xì)胞分類的報(bào)道較多，對(duì)血細(xì)胞種類和數(shù)量的描述卻存在較大的分歧.軟殼蛤(Mya arenaria)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的血細(xì)胞通常被分成2種類型[2-3]；圓硨磲(Tridacna crocea)和淺溝蛤(Scrobicularia plana)的血細(xì)胞則被分為三類[4-5]；海灣扇貝(Argopecten irradians)的血細(xì)胞被分成四類[6]；櫛孔扇貝(Chlamys farreri)的血細(xì)胞甚至被分為六類[7].另外，文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道，淡水貝類褶紋冠蚌(Cristaria)、橢圓背角無(wú)齒蚌(Anodonta woodiana)和三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)均有 4種類型的血細(xì)胞.背角無(wú)齒蚌(Anodonta woodiano)是淡水貝類中的優(yōu)勢(shì)種群，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12].筆者通過(guò)活體血細(xì)胞觀察、細(xì)胞化學(xué)染色及透射電鏡觀察，對(duì)背角無(wú)齒蚌的血細(xì)胞進(jìn)行分類，旨在為貝類免疫學(xué)研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

背角無(wú)齒蚌于2008年10—12月分批采集于江西省鄱陽(yáng)湖，體長(zhǎng) 6～12㎝.室溫下，在水簇箱內(nèi)暫養(yǎng)3～5 d后開(kāi)始試驗(yàn).

1.2 方 法

1.2.1 血淋巴收集

取健康蚌，用2.5 mL(0.6×25針頭)注射器從后閉殼肌取血.血淋巴以1∶2比例與Alsever’s液(葡萄糖20.8 g/L，檸檬酸三鈉8.0 g/L，氯化鈉22.5 g/ L，pH7.2)混合，備用.

1.2.2 活體血細(xì)胞觀察

取血淋巴2.5 mL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，靜置約20 min，用Olympus CX41顯微鏡觀察.

1.2.3 Wrights染色血細(xì)胞觀察

取血淋巴2.5 mL滴于載玻片上，靜置30 min，吸去上層清液，晾干，滴加Wrights染色液染色10 min，加入等量的PBS，染色10 min，PBS沖洗，50%乙醇分色，晾干，中性樹(shù)膠封片后觀察.

1.2.4 血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

取血淋巴20 mL，分裝于2個(gè)10 mL的離心管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min，除去血清，加2.5%戊二醛，固定1～2 h，以0.1 mol/mL的二甲胂酸緩沖液洗滌，1% OsO4后固定、酒精脫水，Epon包埋、Vltracut E型超薄切片機(jī)切片，在日立H-600型電子顯微鏡下觀察.加速電壓為60 kV.

1.2.5 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

取30只健康蚌，每只蚌抽血1次，抗凝處理，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).每毫升血細(xì)胞數(shù)=測(cè)得血細(xì)胞數(shù)×50 000×稀釋倍數(shù).

1.2.6 血細(xì)胞大小測(cè)定

取抗凝血淋巴2.5 mL，滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在27 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用帶目鏡測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡測(cè)量血細(xì)胞直徑和核直徑，細(xì)胞直徑以除偽足外的最長(zhǎng)軸為準(zhǔn)，核直徑以核的最長(zhǎng)軸為準(zhǔn).每種細(xì)胞各測(cè)100個(gè).測(cè)量數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行多層比較分析.

2 結(jié) 果

顯微鏡下，背角無(wú)齒蚌明顯有兩大類型的血細(xì)胞：顆粒細(xì)胞和無(wú)顆粒細(xì)胞.顆粒細(xì)胞和無(wú)顆粒細(xì)胞又有不同的形態(tài)特征.根據(jù)細(xì)胞和胞質(zhì)內(nèi)顆粒的大小特征可以將顆粒細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞.根據(jù)細(xì)胞大小和核質(zhì)比的差異特征又可將無(wú)顆粒細(xì)胞分成透明細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞.

2.1 顆粒細(xì)胞

顆粒細(xì)胞明顯的特征是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有許多顆粒，細(xì)胞核相對(duì)較小，核偏位，核質(zhì)比低.

大顆粒細(xì)胞(Lg)：活體細(xì)胞為圓形或橢圓形，體積比其他血細(xì)胞大.細(xì)胞內(nèi)有折光率高的大顆粒.細(xì)胞一般不伸出偽足或伸出很短的偽足.細(xì)胞核常被大顆粒所覆蓋.大顆粒細(xì)胞通常易破裂，出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象(封三圖1-A).Wrights染色后胞質(zhì)內(nèi)顆粒為嗜酸性，呈現(xiàn)紫紅色或鮮紅色，細(xì)胞核藍(lán)紫色(封三圖 1-a).電鏡觀察發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)有許多電子密度高的大顆粒.細(xì)胞核呈橢圓形或圓形，染色質(zhì)均勻.胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基器等細(xì)胞器(封三圖2-a).

小顆粒細(xì)胞(Sg)：活體細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞易變形，細(xì)胞伸出指狀或根狀偽足.小顆粒細(xì)胞明顯小于大顆粒細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)含有較多的小顆粒，折光率較高(封三圖 1-B).Wrights染色后細(xì)胞表現(xiàn)出嗜酸性和嗜堿性兩種，嗜酸性小顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)為淡紅色，顆粒呈深紅色，細(xì)胞核深藍(lán)色.嗜堿性小顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，顆粒呈深藍(lán)色，細(xì)胞核藍(lán)黑色(封三圖1-b,c).電鏡觀察發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)有許多電子密度高的小顆粒，細(xì)胞核呈圓形或腎形，染色質(zhì)較均勻.細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基器等細(xì)胞器(封三圖2-b).

2.2 無(wú)顆粒細(xì)胞

無(wú)顆粒細(xì)胞明顯的特征是胞質(zhì)內(nèi)不含有顆?；蚝猩倭康念w粒，細(xì)胞核較大，核質(zhì)比高.

透明細(xì)胞(HC)：活體細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形狀，伸出的偽足呈片狀或根狀.胞質(zhì)內(nèi)無(wú)顆?；蛴猩倭款w粒，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形(封三圖1-C).Wrights染色發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞呈嗜酸性，胞質(zhì)為淡紅色，核為深藍(lán)色；另一部分細(xì)胞呈嗜堿性，胞質(zhì)為淡藍(lán)色，核為深藍(lán)色(封三圖1-d,e).電鏡觀察到胞質(zhì)內(nèi)無(wú)明顯的顆粒，但有高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器.細(xì)胞核橢圓形，內(nèi)有濃縮的染色質(zhì)(封三圖2-c).

淋巴樣細(xì)胞(LY)：活體細(xì)胞為圓形，很少伸出偽足，細(xì)胞體積相對(duì)其他血細(xì)胞的體積小，細(xì)胞內(nèi)無(wú)顆粒，細(xì)胞核圓形，居中(封三圖 1-D).Wrights染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈嗜堿性，胞質(zhì)為淡藍(lán)色，核為深藍(lán)色(封三圖1-f).電鏡觀察到細(xì)胞中電子密度低，無(wú)顆粒，細(xì)胞核為橢圓形或圓形，有濃縮的染色質(zhì).胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少(封三圖2-d).

2.3 血細(xì)胞所占比例

測(cè)得背角無(wú)齒蚌血細(xì)胞濃度為(2.42±0.38)×106/mL，其中小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞為主要的細(xì)胞類型，所占比例分別為59.28%和27.74%.大顆粒細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞相對(duì)較少，所占比例分別為4.28%和8.7%.

2.4 血細(xì)胞大小

從表1可以看出，4種血細(xì)胞中大顆粒細(xì)胞的直徑最大，淋巴樣細(xì)胞的直徑最小.統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，4種血細(xì)胞的直徑存在顯著差異.淋巴樣細(xì)胞的細(xì)胞核直徑最大，小顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核直徑最小，血細(xì)胞的核直徑之間沒(méi)有顯著差異.另外，淋巴樣細(xì)胞的核質(zhì)比最大，大顆粒細(xì)胞的核質(zhì)比最小.

表1 背角無(wú)齒蚌4種血細(xì)胞、核的直徑與核質(zhì)比Table 1 Cell, nuclear diameter and N/C of hemocytes of A. woodiana

3 討 論

貝類血細(xì)胞的分類通常依據(jù)血細(xì)胞的形態(tài)特征[3-5]進(jìn)行.由于其形態(tài)特征存在較大變化，因此，建議結(jié)合血細(xì)胞的生理生化特性及其功能進(jìn)行分類[13].Cheng[14]認(rèn)為貝類血細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中含有許多顆粒的是顆粒細(xì)胞，胞質(zhì)中沒(méi)有或有少量顆粒的是無(wú)顆粒細(xì)胞.事實(shí)上，貝類血細(xì)胞存在許多過(guò)渡類型[15].根據(jù)血細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒的大小，顆粒細(xì)胞還能夠分成大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞[3,6,16].劉東武等[17]利用流式細(xì)胞儀分析菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的血細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)除了大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞外，還有介于兩者之間的血細(xì)胞，稱為中顆粒細(xì)胞.另外，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)顆粒的組織化學(xué)特性還能夠?qū)㈩w粒細(xì)胞分為大嗜酸性顆粒細(xì)胞和小嗜酸性顆粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞[18].

筆者發(fā)現(xiàn)背角無(wú)齒蚌的顆粒細(xì)胞除了細(xì)胞和顆粒大小有較大差異外，顆粒細(xì)胞的形態(tài)及伸展情況也存在較大的差別.有些細(xì)胞很少伸出偽足，而另一些則常伸出根狀偽足，因此，筆者將背角無(wú)齒蚌的顆粒細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞.Zhang等[6]和羅文等[10]通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)大顆粒細(xì)胞內(nèi)含有電子密度高的大顆粒.在背角無(wú)齒蚌的大顆粒細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了許多直徑較大的顆粒，電子密度也較高.Nakayama等[4]與沈亦平等[8]描述的漿液細(xì)胞也具有大顆粒細(xì)胞的類似特征，可能與本研究中的大顆粒細(xì)胞是同一類細(xì)胞.此外，Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)大顆粒細(xì)胞是多核細(xì)胞，而本研究與陳全震等[16]僅觀察到單核的大顆粒細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)大顆粒細(xì)胞容易出現(xiàn)脫顆粒的現(xiàn)象.

小顆粒細(xì)胞是背角無(wú)齒蚌血細(xì)胞中數(shù)量最多的一類血細(xì)胞，細(xì)胞體積小于大顆粒細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)含有大量的小顆粒，這與Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)的小顆粒細(xì)胞特征一致.筆者發(fā)現(xiàn)的小顆粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力強(qiáng)于其他3類血細(xì)胞，因此，認(rèn)為小顆粒細(xì)胞是背角無(wú)齒蚌免疫防御的主要血細(xì)胞.

多數(shù)研究者認(rèn)為，無(wú)顆粒細(xì)胞可以分為更多的亞群，其中一類亞群細(xì)胞的體積較大，細(xì)胞核較小，偏位，細(xì)胞數(shù)量也較多，細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有明顯的顆粒，通常稱之為透明細(xì)胞或大透明細(xì)胞[4,6].筆者觀察到的透明細(xì)胞同樣具有這些特征.此類細(xì)胞在背角無(wú)齒蚌血細(xì)胞中的比例僅次于小顆粒細(xì)胞，并具有吞噬能力，可能也是背角無(wú)齒蚌免疫防御的主要血細(xì)胞之一.另外，在貝類血細(xì)胞中還有一類細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核大，核居中，形態(tài)類似于哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞，通常命名為小淋巴細(xì)胞[19]，也有稱為類淋巴細(xì)胞[9]、擬淋巴細(xì)胞[7]、淋巴樣細(xì)胞[16]、小透明細(xì)胞[6].一般認(rèn)為該類細(xì)胞是未成熟的血細(xì)胞[19].筆者也發(fā)現(xiàn)了該類細(xì)胞.由于貝類沒(méi)有真正的淋巴系統(tǒng)，也無(wú)淋巴細(xì)胞，只有類似高等動(dòng)物淋巴細(xì)胞的小型血細(xì)胞，因此，筆者根據(jù)該類細(xì)胞的特征稱其為淋巴樣細(xì)胞.

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