張婧源，彭燕，羅燕，馬嘯

（四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系，四川 雅安625014）

相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequence－related amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的基于聚合酶鏈式反應的標記系統(tǒng)，也稱基于序列擴增多態(tài)性（sequence－based amplified polymorphism，SBAP）。是利用獨特的引物設計對ORFs（open reading frames，開放閱讀框架）進行擴增。由于SRAP技術(shù)簡便、快速，不需預知物種的序列信息，故而近年來在植物遺傳多樣性分析［1］、種質(zhì)鑒定［2］、遺傳連鎖圖的構(gòu)建［3］、基因連鎖標記的尋找與基因定位［4］和比較基因組學研究［5］等方面得到廣泛應用。目前在蕓苔屬（Brassica）［4］、南瓜屬（Cucurbita）［6］、芍藥屬（Paeonia）［7］以及柿子（Diospyroskaki）等植物［8］已經(jīng)展開SRAP標記的研究工作，并已取得了一定的成果。在草業(yè)上SRAP也已有了較多的應用，如野牛草（Buchlo?dactyloides）［9］、垂穗披堿草（Elymusnutans）［10］和結(jié)縷草（Zoysiajaponica）［11，12］等草種，但就豆科（Leguminosae）植物而言，僅見于紫花苜蓿（Medicagosativa）［13］、花生（Arachishypogaea）［14］等少數(shù)植物。

白三葉（Trifoliumrepens）別名白車軸草、荷蘭翹搖，為豆科（Leguminosae），三葉草屬（Trifolium），全屬在世界約有250余種，原產(chǎn)于歐洲、北非和亞洲西部，在溫帶及亞熱帶地區(qū)均有分布。為世界上分布最廣的豆科牧草之一［15］。由于白三葉莖葉細軟，葉量多，營養(yǎng)豐富，尤富含蛋白質(zhì)，適口性好，刈牧兼用，耐踐踏，再生性好等特點使其種植已遍布我國各地，尤其在長江以南地區(qū)大面積栽培，在長江中下游平原的鄂、湘、江、浙、皖等省，以及低山丘陵區(qū)的云、貴、川、廣等省均有種植，是我國南方的當家豆科牧草［16］。國內(nèi)外學者已通過形態(tài)標記、細胞學標記和同工酶生化標記等，對白三葉種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)與生態(tài)型遺傳分化及種質(zhì)間遺傳多樣性進行研究［17－19］。由于分子標記技術(shù)簡單、快捷、受環(huán)境影響小和可重復性強等優(yōu)點，目前已被廣泛應用在牧草遺傳研究中，因此對白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性方面的研究也逐步深入到了分子水平。在國外，對白三葉的分子水平上的研究相對更多，Sharmas等［20］利用形態(tài)學和RAPD分子標記（隨機擴增多態(tài)性DNA標記）對外來引進白三葉品種遺傳多樣性進行了分析，Gustine和Huff［21］利用RAPD標記分析了美國東北部3個州人工管理的多年生牧場中白三葉種群內(nèi)和種群間的遺傳變異，Joyce等［22］利用RAPD－PCR分子標記（基于聚合酶鏈式反應的隨機擴增多態(tài)性DNA標記）對近緣雜交的白三葉的遺傳多樣性進行了分析，George等［23］利用SSR標記（串聯(lián)重復序列DNA標記）檢測了不同產(chǎn)地白三葉品種的遺傳多樣性，K?lliker等［24］對白三葉進行了AFLP分子標記（擴增片段長度多態(tài)性DNA標記），Barrett等［5］更首次利用EST－SSRs（基于表達序列標簽的串聯(lián)重復序列DNA標記）制作了白三葉的完整基因連鎖圖；而國內(nèi)對于白三葉在DNA分子遺傳多樣性方面的研究報告相對較少，隨著白三葉在我國草地畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整和生態(tài)環(huán)境建設等方面占有越來越重要的地位和作用，急切的需要開展更進一步的分子水平的白三葉種質(zhì)資源遺傳特性的基礎研究。

本試驗利用SRAP標記技術(shù)對來自5大洲的41份白三葉種質(zhì)進行遺傳多樣性研究，目的在于：1）檢測白三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性水平與地理來源的關(guān)系；2）分析白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為優(yōu)良白三葉種質(zhì)資源篩選提供依據(jù)；3）揭示白三葉種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系，為白三葉種質(zhì)資源的保護、栽培利用以及核心種質(zhì)的構(gòu)建提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的41份白三葉種質(zhì)材料均來源于美國國家遺傳資源庫（United States Department of Agriculture），其中源自非洲的材料有8份、亞洲7份、大洋洲5份、歐洲13份、美洲6份、亞歐交界2份（表1）。每份材料取50粒種子，置于有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)的吸水濾紙上萌發(fā)。萌發(fā)后的種子移栽至四川省眉山市洪雅縣國家種質(zhì)資源圃（東經(jīng)102°49′～103°32′，北緯29°24′～30°00′，海拔2 800 m）種植。

1.2 白三葉基因組DNA提取

本試驗于2009年7月進行。每份材料采用Saghai－Maroof等［25］的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）方法隨機選取10～15個生長良好的單株的幼嫩葉片等量混合提取DNA。對比已知濃度的標準λDNA與樣本DNA在0.8%（w／v）瓊脂糖凝膠上的電泳圖譜，計算出白三葉各種質(zhì)材料的DNA濃度。將所有樣本的基因組DNA用0.1×TE緩沖液［1 mmol／L Tris－HCl，0.1 mmol／L EDTA（乙二胺四乙酸），p H 8.0］稀釋至10 ng／μL，儲存于－80℃冰箱內(nèi)，供SRAP擴增使用。

1.3 SRAP反應體系的建立及優(yōu)化

參照前人發(fā)表的SRAP反應體系［26－28］，利用單因素梯度組合試驗的方法，得到優(yōu)化后20μL SRAP反應體系：模板DNA 2μL（10 ng／μL），10×PCR Bufer 2μL，Mg2＋2μL（25 mmol／L），d NTP 1.4μL（2.5 mmol／L），Taq DNA聚合酶0.4μL（2.5 U／μL），上、下游引物均為1μL（10μmol／μL），滅菌水補足20μL。

1.4 引物篩選和PCR反應

參照前人發(fā)表的引物［29－33］，由9個上游引物和12個下游引物組合成108對SRAP引物序列，交由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成，選取4個DNA質(zhì)量較高且田間試驗性狀差異較大的材料PI282379，PI404930，PI291841，PI440745對108對引物進行篩選，最終選出20對條帶清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好的引物用于全部材料進行PCR擴增，引物序列見表2。

PCR擴增程序參見Li和Quiros［4］的方法，采用以下程序：循環(huán)包括94℃變性5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min，共5個循環(huán)；之后35個循環(huán)：94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min；4℃保存。

1.5 電泳檢測

擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上（丙烯酰胺∶甲叉＝19∶1，7 mol／L尿素，1×TBE緩沖液）進行電泳檢測。樣孔中每樣品點樣10μL，以博瑞克公司的D2000 DNA梯度Marker為對照，先在北京六一電泳儀廠的DYY－6C電泳儀上進行200 V恒定電壓下30 min的預電泳，然后在400 V恒定電壓下電泳90～100 min，停止電泳后再用0.1%的Ag NO3進行銀染色并在NaOH液中顯色［29］，凝膠在燈光下用高分辨率數(shù)碼相機照相保存以供分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對獲得的清晰可重復的DNA條帶進行統(tǒng)計，在相同遷移位置上，將穩(wěn)定出現(xiàn)的有條帶的記為1，無帶的記為0，依次構(gòu)成遺傳相似矩陣。

據(jù)表征矩陣，統(tǒng)計SRAP擴增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)量，計算多態(tài)性位點百分率（PPB，percentage of polymorphic bands）、引物多態(tài)性信息含量（PIC，polymorphism information content）和Dice遺傳相似系數(shù)（GS）

來估計各種質(zhì)間的遺傳多樣性［30，34，35］。各遺傳參數(shù)按以下公式計算：PPB＝NPB／TNB，式中，TNB指總擴增的SRAP條帶數(shù)（total number of bands），NPB指多態(tài)性條帶數(shù)（number of polymorphic bands）；PICi＝2fi（1－fi），式中，PICi表示引物“i”的多態(tài)性信息含量，“fi”表示有帶所占的頻率，“1－fi”表示無帶所占的頻率，對每個引物組合而言，計算PIC應該求平均值，即PICav＝∑PICi／N，這里N是各引物組合的多態(tài)性帶數(shù)（NPB）［31］；標記指數(shù)（MI，marker index）MI＝NPB×PIC［23］。在 Hardy－Weinberg平衡的基礎上，計算各種質(zhì)材料 Nei基因多樣性指數(shù)［33］，利用 NTSYS－PC 2.10軟件計算 Dice遺傳相似性系數(shù)（GS），根據(jù) UPGMA 法［36］進行聚類分系和主成分分析（PCo A）。

表1 供試材料及來源Table 1 The test materials and sources of T.repens

表2 用于白三葉SRAP分析的引物序列Table 2 Primer and sequences used in SRAP analyses of T.repens

以上參數(shù)計算分別在POPGENE 1.31、DCFA 1.1中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試白三葉SRAP擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

從108對引物組合中篩選出20對條帶清晰、多態(tài)性好的引物組合（表3）對41份白三葉基因組DNA進行PCR擴增，共得到479條清晰可辨的條帶，平均每對引物組合擴增出23.95條帶，me5＋em9引物組合擴增出最多的44條帶，而me4＋em6組合擴增出的條帶最少，僅有13條；多態(tài)性條帶總數(shù)411條，平均每對引物擴增20.55條，引物的平均多態(tài)性位點百分率（PPB）為85.16%，不同的SRAP引物組合所揭示的參試材料的多態(tài)性信息含量（PIC）范圍為0.182～0.334，平均為0.268；不同的SRAP引物組合的標記指數(shù)（MI）為2.185～11.068，平均為5.697。結(jié)果表明SRAP分子標記能檢測出較多的白三葉遺傳位點，獲得多態(tài)性相對較好的PCR結(jié)果。

表3 白三葉SRAP分析的引物組合以及其序列擴增結(jié)果Table 3 Primer combinations and sequences used in SRAP analyses of T.repens

2.2 不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)親緣關(guān)系分析

對擴增結(jié)果用Nei－Li相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD）的計算方法，得到供試材料相似性矩陣。41份白三葉材料的 GS值為0.586 6～0.989 6，GS平均值為0.730 7，變幅為0.403，其遺傳距離GD（1－GS）為0.010 40～0.413 40，平均為0.269 4。其中，來自非洲肯尼亞的PI516408與來自歐洲法國的PI294544之間的遺傳距離最大，為0.413 4，表明它們之間的親緣關(guān)系較遠。而來自非洲南部的2份種質(zhì)PI300155和PI300156之間的遺傳距離最小，僅為0.010 4，表明這2份材料之間具有很近的親緣關(guān)系。分析結(jié)果表明，供試材料之間差異明顯，具有相對較遠的親緣關(guān)系。

2.3 不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)的聚類分析

基于（Nei－Li）遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法（非加權(quán)組平均法）構(gòu)建了41份白三葉材料間的遺傳關(guān)系聚類圖（圖1）。在遺傳相似系數(shù)為0.71的水平上，可將供試白三葉種質(zhì)分為3大類。其中，非洲、亞洲和大洋洲的20份材料聚為第Ⅰ類，該類大部分種質(zhì)的形態(tài)及農(nóng)藝性狀表現(xiàn)為前期生長速度快、分蘗能力強、花期遲、完成生育期所需時間較短，植株相對高大，生態(tài)適應能力較強。該大類中源于非洲的8份材料，PI282379、PI300155、PI300156、PI226102、PI516408、PI278171、PI517515、PI322699優(yōu)先聚為A亞類，然后源于大洋洲的5份材料，PI517508、PI190125、PI291844、PI291841、PI291849聚為B亞類，源于亞洲的7份材料，PI420014和PI420010，PI227874和PI239983以及PI221962、PI223297和PI269981分屬于C、D、E亞類。來自歐洲和美洲的19份材料，PI237734、PI232112、PI294544、PI288084、PI288085、PI249873、PI221524、PI234489、PI516410、PI237292、PI315543、PI208567、PI282377、PI404930、NSL5459、G15242、PI306286、PI291826和PI308549聚為第Ⅱ類，該類主要特征表現(xiàn)為花期較早，植株低矮，葉片極小。而來自亞歐交界處的2份材料，PI209986和PI440745單獨成為第Ⅲ類。這樣的聚類結(jié)果揭示了供試材料的聚類與其形態(tài)特征、最初的地理來源以及地理分布存在一定相關(guān)性。

圖1 41份白三葉種質(zhì)基于Nei－Li相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram for T.repens based on Nei－Li’s genetic similarity coefficients

2.4 供試材料的主成分分析

對41份白三葉材料的SRAP標記的原始矩陣進行主成分分析，前2個主成分所能解釋的遺傳變異分別為15.83%和8.16%，對41份種質(zhì)做前2個主成分的三維排序圖，位置靠近者表示關(guān)系密切，遠離者表示關(guān)系疏遠，將位置靠近的白三葉材料歸為一類，可將供試材料分成3類，所形成的白三葉材料的位置分布圖（圖2）所示，主成分分析結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致，同一地區(qū)的大部分白三葉材料基本能聚在一起，主成分分析的結(jié)果更直觀地表明了不同白三葉材料之間的親緣關(guān)系，是對聚類分析結(jié)果的直觀解釋和佐證。

3 討論

3.1 SRAP分子標記對白三葉遺傳多樣性研究的有效性

本研究利用SRAP標記對41份白三葉種質(zhì)進行遺傳多樣性的分析，結(jié)果表明，白三葉SRAP標記表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，高于RAPD分子標記對三葉草屬其他物種的研究，例如Kongkiatngam等［37］對不同地區(qū)紅三葉栽培品種的RAPD分析研究中所選樣本的PPB為69.6%，Ulloa等［38］對紅三葉（Trifoliumpratense）的RAPD研究所得的PPB為74.2%，同時也高于同科植物紫花苜蓿的SRAP分析結(jié)果（PPB為83.88%）［39］，這些差異可能是由于材料和研究方法的不同造成的。由此說明SRAP技術(shù)對白三葉的擴增具有較高的效率，適合對大規(guī)模白三葉種質(zhì)的遺傳變異檢測，可作為白三葉新品種選育的早期選擇及分子標記輔助育種的有力工具。

圖2 41份白三葉種質(zhì)基于Nei－Li相似系數(shù)的主成分分析Fig.2 The principal coordinate analysis（PcoA）of 41 T.repens based on Nei－Li’s genetic similarity coefficients

3.2 白三葉種質(zhì)遺傳變異與地理來源的相關(guān)性分析

遺傳變異和地理環(huán)境之間的關(guān)系一直是植物遺傳學研究中普遍關(guān)注的問題。本試驗通過對41份來自世界各地不同大洲的白三葉材料的SRAP統(tǒng)計分析和聚類分析，證明供試白三葉種質(zhì)呈現(xiàn)出一定地理來源分布規(guī)律和地域分布性規(guī)律，這也與Wilson等［40］的研究所得，種質(zhì)的地理分布與分子標記間存在相關(guān)性的結(jié)論相符合。通過研究發(fā)現(xiàn)白三葉材料間存在著較高的遺傳分化，而聚類分析把41份材料分為3大類，也揭示了3個與地理起源密切相關(guān)的遺傳多樣性資源群。從供試材料的聚類圖可以看出，相似的生態(tài)環(huán)境或地理來源的白三葉種質(zhì)能聚為一類，主要表現(xiàn)在來自美洲和歐洲的全部材料聚為第II類，這種聚類分析的結(jié)果可能與白三葉起源于歐洲，并由歐洲傳入美洲有關(guān)，由于大陸間地形的相互阻隔造成了基因漂移的阻隔，加上相同起源地白三葉材料原有基因突變在物種進化過程中適應了各地域間海拔高度、土壤類型、氣候特征和降水等方面存在的差異，從而使其固有的個別變異基因得以保存并延續(xù)下來，最終使不同來源地的白三葉材料間呈現(xiàn)出按起源地分布的規(guī)律，這一研究結(jié)果與謝國祿［41］的研究相一致。

與此同時第I類在GS為0.75時，來自非洲的全部材料和來自大洋洲的全部材料又分別聚為A、B 2個亞類，這說明白三葉種質(zhì)資源呈現(xiàn)一定的地域分布規(guī)律，而造成這一結(jié)果可能是在白三葉材料的長期進化過程中由于所處生長環(huán)境的不同，地理類型、土壤酸堿度、年積溫和年降水量、日照時數(shù)等生態(tài)環(huán)境因子的明顯差異對白三葉生長期的自然選擇造成一定影響，加上自然突變、人為選擇等其他因素，使各方面都存在了一定的變異度，使得個體中發(fā)生的不定向變異導致群體遺傳結(jié)果的定向變異，最終使同一地區(qū)材料的基因型趨近于相似。

另外部分聚類也非完全符合地理起源和地域性的分布規(guī)律，如來自亞洲的所有材料在GS為0.75時就分別聚成了C、D、E 3個亞類，造成這種聚類劃分的現(xiàn)象可能有以下方面的原因：1）白三葉是異花授粉植物，花粉間的竄粉可能導致天然雜交現(xiàn)象的出現(xiàn)；2）本研究的材料來源于生境差別較大，其光照、降水、年均溫等氣候條件以及土壤、海拔、經(jīng)緯度、洋流等生境條件存在差異，因此可能阻礙種質(zhì)間的基因漂移，從而造成了較明顯的遺傳差異，這也符合聚類結(jié)果與生境表現(xiàn)出一定的相關(guān)性［42］的研究結(jié)論；3）由于自然選擇所造成的選擇壓力也可能導致生境相距存在差異的種質(zhì)產(chǎn)生遺傳變異，加上人類活動以及利用方式的不同都可能導致其個別基因發(fā)生變異［43］，從而形成遺傳的多樣性，這也符合聚類的結(jié)果反映出自然和人工選擇的深刻影響［14］的研究結(jié)論。

這一研究結(jié)果為今后制定世界范圍內(nèi)白三葉資源遺傳多樣性原位保護措施、保護范圍以及白三葉品種改良中親本選擇、發(fā)掘新的抗逆基因提供了重要參考。針對白三葉所潛藏的巨大的可選擇利用的優(yōu)異性狀，應充分發(fā)掘其原生種質(zhì)的遺傳潛力，培育出更多適應性更強，農(nóng)藝性狀更優(yōu)良的品種。

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